摘要
猪传染性胸膜肺炎（PCP）和猪肺疫是猪的两种重要呼吸道疾病，分别由胸膜肺炎放线杆菌（APP）和多杀性巴氏杆菌（Pm）引起。急性发病的猪死亡率较高，慢性耐过的猪常常出现进行性营养不良、消瘦，料肉比增加，给养猪业带来巨大的困扰。更为重要的是，这两种疾病常常与猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等发生混合或继发感染，给呼吸道综合征的防治带来更大困难。临床上这两种病的爆发时常出现，抗生素便成为了治疗的首选，然而抗生素带来的兽药残留和细菌耐药性的问题较为严重，引起了国际的高度重视。因此，疫苗免疫预防仍然是控制这两种疾病最经济最有效的手段。灭活苗仍然是大部分疾病疫苗免疫的首选，其安全、高效、容易保存等优点在养殖业和科学研究者中达成共识。猪传染性胸膜肺炎和猪肺疫的单价疫苗在临床上偶有使用，但效果往往不令人满意，究其原因是流行血清型发生改变，导致原来的传统疫苗不能有效的提供交叉保护力。另外，二联或多联疫苗的使用，可以减少免疫次数，降低生猪应激，减少疾病发生。因此，为了有效控制猪传染性胸膜肺炎和猪肺疫在我国发生和流行，本课题通过流行病学调查和细菌分离鉴定，筛选流行的优势血清型菌株，进一步通过研究细菌生物学特性、毒力和免疫原性，筛选出制苗菌株，制备单价疫苗，为后续二联疫苗的研制、有效预防这两种疾病的发生和流行奠定基础。 本研究主要内容包括：⑴从大量新鲜发病肺组织进行细菌的分离、鉴定和纯化，根据细菌的培养特性并结合革兰氏染色镜检和PCR鉴定方法，最终得到32株Pm，20株APP。接着用PCR的方法对Pm进行血清型鉴定，获得12株血清A型菌株，20株血清D型菌株，这些菌株都是不产毒素菌株。使用复合PCR对APP进行血清型鉴定，2014年最终得到1型APP菌株5株，5型APP菌株5株。通过小鼠的毒力实验，我们分别得到了A型Pm、D型Pm和1型APP的最强毒力菌株。首先将筛选最强毒力的A型Pm、D型Pm分别制成单价灭活苗，设三个浓度梯度去免疫Balb/C小鼠，同时设立生理盐水和生理盐水+佐剂的对照组，进行2次免疫，二免14天后进行攻毒。结果表明，生理盐水组的小鼠全部死亡，生理盐水+佐剂组保护率分别12.5%和25%，而实验组中保护率随免疫剂量的加大而加大（分别从25%增加到62.5%和从37.5%增加到62.5%）。这些结果表明我们筛选出来的制苗菌株是符合制备疫苗要求的。⑵将制苗用的A型和D型Pm活化后，挑单菌落于液体培养基中摇动过夜培养，第二天按1:100进行转接，然后每1小时测其OD600，总共测13小时，然后绘制成生长曲线图，从结果发现转接后2小时，细菌均进入对数期，8小时后到达稳定期，一直持续到13小时，说明转接后8~13小时细菌总数最多，是最佳收集菌体时间。⑶细菌灭活时间的长短直接关系到疫苗效果的好坏，我们于灭活后每6h进行取样检验灭活效果，结果发现细菌灭活后6h再已经没有活菌生长。⑷用20亿CFU剂量的Pm去感染断奶仔猪，从猪的临床表现、病理变化、组织切片和分菌鉴定进行评价，最终复制出猪肺疫的病理模型。然后A型和D型Pm各用3个剂量梯度去感染猪，最终确定出猪的绝对致死剂量。将制得的灭活单苗均以2×109CFU的剂量去免疫仔猪，同时设立阴性对照组，二免后7天用1.5倍绝对致死剂量进行攻毒，结果阴性对照组的猪全死，而A型Pm灭活单苗保护率为25%，D型Pm灭活单苗保护率为100%。⑸ELISA检测抗体方法的建立主要是确定抗原包被形式、抗原包被浓度和血清稀释度。ELISA抗原包被采用全菌抗原包被的方法，包被浓度依次为8×108CFU、5×108CFU、3×108CFU、1×108CFU、8×107CFU、5×107CFU、3×107CFU、1×107CFU，血清稀释度依次为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640，然后进行方阵滴定，最终得到A型和D型Pm抗原的最佳包被浓度均是1×107 CFU，血清稀释度为1:320。初步建立检测Pm灭活单苗抗体ELISA方法。
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