摘要
为充分利用茯苓加工过程中废弃物茯苓皮，合理开发相关附加值产品，延伸茯苓行业产业链。本文选用湖北省罗田县九资河茯苓皮为研究材料，采用传统及现代提取分离技术对其中三萜类物质进行了提取工艺探索；通过溶剂萃取、柱层析、高效液相色谱等现代分离分析手段对提取物进行分离纯化；采用紫外吸收光谱（UV）、红外吸收光谱（IR）、液质联用技术（LC-MS）对提取纯化物进行了结构解析；考察了三萜类提取物对常见微生物的抑菌活性。主要研究结果如下： 1.分别采用传统回流法和超临界二氧化碳萃取法（SFE-CO2）对茯苓皮中三萜类化合物进行了提取比较研究。优选出了三萜类物质SFE-CO2提取工艺条件：夹带剂用量2.0mL/g、萃取压强35MPa、萃取温度65℃、萃取时间60min。利用香草醛-冰乙酸-高氯酸与三萜类化合物反应生成有色物质原理，以标准品熊果酸为对照，通过分光光度法对茯苓皮中提取的三萜类物质总含量进行了测定。提取物中三萜含量分别为：SFE-CO2萃取时为2.06%，传统回流提取时为1.39%，SFE-CO2萃取率为82.4%，较传统回流法的55.6%高出26.8%。将此技术应用到茯苓皮三萜类化合物的提取实践中，可缩短生产周期，提高产品得率。因此，本实验所建立的提取工艺具有较好的应用前景。 2.采用试管预示法和圆形滤纸预示法系统地对茯苓皮提取液中所含成分进行了测定，通过颜色反应，荧光分析等手段判断其所含成分。结果表明茯苓皮提取物中含有大量的生物活性成分：蛋白质、多肽、氨基酸、多糖及其苷类、有机酸、皂苷、植物甾醇和三萜类物质、强心苷，可能含有鞣质、生物碱，未检测到酚性成分、黄酮及其苷类、蒽醌及其苷类。 3.在优选出的SFE-CO2条件下所得茯苓三萜提取液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，薄层色谱法对萃取后的样品进一步分析，通过比较不同展开剂对样品的分离效果，优选出的展开剂体系为甲苯:乙酸乙酯:冰乙酸=20:4:0.6，显色剂为10%硫酸乙醇溶液。对高效液相色谱的流动相组成、配比等条件进行了优化，其洗脱条件为：流动相A乙腈，B水+0.1%甲酸（0-20min A48-53%，20-40min A53-58%，40-60min A58-63%，60-100min A65%），流速1mL/min，柱温30℃，检测波长242nm，进样量10μL，Waters C18柱（150mm×4.6mm，5μm）。对纯化后的茯苓皮提取物中三萜进行了UV、IR、LC-MS分析，初步鉴定出了16种茯苓三萜类物质。 4.应用牛津杯实验法，通过测定抑菌圈直径大小和最小抑菌浓度两项指标，鉴定茯苓皮粗提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌的抗菌活性。研究表明在20mg/mL浓度下，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，对黑曲霉和白色念珠菌无抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强，抑菌圈平均直径为16.30mm，属于高度敏感；大肠杆菌次之，抑菌圈平均直径为15.37mm，属于高度敏感；枯草芽孢杆菌较弱，抑菌圈平均直径为11.32mm，属于中度敏感。五种菌的最小抑菌浓度（MIC）分别：金黄色葡萄球菌MIC为7.5mg/mL；大肠杆菌MIC为15 mg/mL；枯草芽孢杆菌MIC为30mg/mL；黑曲霉和白色念珠菌MIC均为60 mg/mL。
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