摘要
目的：手足口病是亚太地区重大的公共卫生问题之一，主要发生在年龄≤5岁的儿童，主要的病原体是柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)。EV71是一种高传染性病毒和嗜神经肠道病毒，已多次在亚太地区引发了手足口病的暴发和流行，是重症手足口病和死亡病例的主要病原体。自从EV71在中国首次报道后，EV71引起的手足口病疫情在中国呈不断上升趋势，给中国带来了极大的经济和疾病负担，是中国面临的重大公共卫生问题之一。1998年之后，EV71C4基因亚型（EV71subgenotype C4，EV71-C4）几乎成为唯一一种在中国大陆流行的EV71基因亚型。目前仍无有效针对EV71的抗病毒药物，早发现、早诊断和早治疗有助于及时防止EV71疫情扩散，延缓病情的进展。因此，建立一种早期、快速、准确的EV71-C4检测方法对于中国大陆预防重症手足口病、减少死亡率和控制疾病的传播具有重要的意义。 重组聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新型的等温扩增技术，具有简单、快速、灵敏度和特异度高的特点，不需要复杂的设备和专业的操作人员。自从RPA技术被开发出来以后，该检测技术已应用于艾滋病、登革热、诺如病毒等多种病原体的检测，但目前还未将RPA技术应用于EV71的检测。本研究拟建立针对EV71-C4的逆转录重组聚合酶扩增（RT-RPA）方法，并对其进行评价，以期建立一种可用于疾病暴发现场的EV71-C4的快速低成本的检测方法。 方法：以毒株SZ/HK08-6(GenBank accession no.GQ279370.1)作为参考序列，针对VP1基因的保守区域设计引物和探针，筛选出最佳的引物和探针组合，建立EV71-C4的RT-RPA快速检测方法，并对其灵敏度、特异度和临床应用可行性进行评价。制各样本RNA标准品，同时使用RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR检测系列稀释的样本RNA标准品，计算并比较三种方法的95％检测限。用柯萨奇病毒A组（CV-A2，-A4，-A5，-A6，-A9，-A10和-A16）、柯萨奇病毒B组(CV-B2，和-B4)、埃可病毒9和诺如病毒GⅡ.17评价RT-RPA检测方法的特异度。同时用RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR检测178份疑似手足口病的临床粪便样本，以RT-qPCR的检测结果作为金标准，将RT-RPA和RT-PCR的检测结果与RT-qPCR的检测结果进行比较，评价RT-RPA检测方法的临床应用价值。 结果：本研究所建立的EV71-C4RT-RPA检测方法，在40℃的条件下，反应时间≤10min。特异度为100％，只有阳性样本检测到了扩增信号，而特异性评价病毒和临床阴性样本均未检测到扩增信号。经概率元分析，可得RT-RPA、RT-qPCR和RT-PCR的95％检测限分别为3.767(95％CI，3.489to4.283)、2.026(95％CI，1.645to2.710)和4.921(95％CI，4.628to5.382)LGC/反应。在临床样本的评价中，以RT-qPCR的检测结果作为金标准，44个份粪便样本的检测结果表明，RT-RPA检测方法灵敏度和特异度均为100％，而RT-PCR的灵敏度和特异度分别为90.0％(18/20)和91.7％(22/24)。基于另外134个粪便样品的测定结果表明，RT-RPA检测方法的灵敏度和特异度分别为89.5％(68/76)和100.0％(58/58)，而RT-PCR的灵敏度和特异度分别为63.2％(48/76)and89.7％(52/58)。RT-RPA检测方法的临床性能与RT-qPCR无显著性差别，但要优于RT-PCR。 结论：本研究建立的针对EV71-C4的RT-RPA检测方法，操作简单，反应时间短，在临床样本的检测中表现出了较高的灵敏度与特异度，适用于经济欠发达地区及传染病暴发现场的快速检测。
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