摘要
寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV），属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属，是单股正向RNA病毒。2015年，巴西地区暴发了重大ZIKV疫情，造成数百万人感染，引起了世界各国公共卫生部门的高度关注及警惕。ZIKV病毒感染可能与神经和自身免疫系统并发症有关，如产前小头畸形(PM)和格林-巴利综合征(GBS)，给当地带来了严重的疾病负担。此外，由于ZIKV与登革病毒(Denguevirus，DENV)、黄热病毒(Yellow Fever virus，YFV)及基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)具有相同的传播媒介，感染后的早期临床症状非常相似，这给疾病的早期诊断带来困难。早期及时的有效诊断有利于尽早辨别感染、控制疾病的发展与流行，因此，针对ZIKV的防控急需建立能区分鉴定这四种病毒的检测试剂。 目前ZIKV的诊断方法主要有三种:病毒分离培养、血清学检测及实时荧光定量RT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)。病毒分离培养是病毒检测及鉴别的金标准，但是其耗时费力，不适用于ZIKV的早期诊断;血清学检测主要包括ELISAs及中和实验等，在ZIKV感染的临床早期阶段，患者血清中的IgM抗体滴度低而出现假阴性结果;且产生的抗体容易与DENV、YFV及CHIKV等感染产生的抗体发生交叉反应而出现假阳性结果，因此，血清学检测也不建议用于ZIKV的鉴别诊断。实时荧光qRT-PCR方法由于具有快速、灵敏及特异等优点，已被广泛用于上述四种病毒的诊断研究，但是，目前尚未建立这四种病毒多重qRT-PCR的检测方法。因此，我们拟建立多重检测qRT-PCR用于对这四种病毒的快速检测及鉴定。 从GenBank下载这四种病毒的全基因组序列后，在MEGA5.0软件中用Clustal W方法进行多序列比对来确定病毒的特异、保守区域，再针对病毒基因组的保守区域进行引物与探针的设计;以商品化单重实时荧光qRT-PCR试剂为对照，建立了针对这四种病毒的单重实时荧光qRT-PCR。其后，以DENV单重实时荧光qRT-PCR为基础，依次建立DENV、CHIKV两重qRT-PCR，DENV、CHIKV、ZIKV三重qRT-PCR及最终的四重qRT-PCR。在对四重qRT-PCR的反应体系及扩增条件进行优化之后，我们对其检测性能进行了评价。四重qRT-PCR对这四种病毒的95％检测下限为11～32 copies/test，标准曲线的扩增线性R2＞0.98。在不同病毒载量重叠感染的检测上，四重qRT-PCR对其中任一种病毒检测的Ct值与单重实时荧光qRT-PCR检测的Ct值无明显差别(P=0.26＞0.05)。在模拟ZIKV临床标本检测上，四重qRT-PCR与商品化单重qRT-PCR试剂检测的平均Ct值相似，偏差仅为0.08(95％CI:-0.68～0.84)。此外，四重qRT-PCR的特异性达100％，检测不同浓度RNA模板的变异系数＜3％。 综上所述，本研究成功建立了ZIKV、DENV、YFV及CHIKV的四重qRT-PCR体系，其能够快速有效地鉴别诊断ZIKV、DENV、YFV及CHIKV的感染，有利于疾病的早期治疗处理，并控制疾病的流行，为ZIKV的防控提供重要的保障。
NETL