摘要
睾丸组织高表达的基因不仅对生殖细胞的生物学过程非常重要，而且与多种肿瘤的发生密切相关，其中最有代表性的就是癌睾抗原。miRNA和DNA甲基化是调控基因表达的两个主要的表观遗传因素。为了发现睾丸组织高表达基因在miRNA和DNA甲基化方面的表观遗传调控机制，本课题以非梗阻性无精症(Non-obstructive azoospermia，NOA)和梗阻性无精症(Obstructive azoospermia，NOA)患者的睾丸组织为样本，首先运用基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱芯片筛查了差异表达的基因、miRNA和甲基化位点，然后通过荧光定量PCR技术对芯片结果进行了实验验证，发现两个功能未知的基因PLCXD3和ZCCHC13，它们在生精功能正常的OA睾丸组织中呈强阳性表达，而在精子生成障碍的NOA睾丸组织中未见表达，推测二者对精子生成有重要作用。接着结合生物信息学预测信息，在生殖细胞系和肿瘤细胞系中对着两个基因的靶miRNA，以及ZCCHC13基因的甲基化调控进行了深入研究。本课题的主要研究结果如下: 1.建立了NOA和OA的睾丸组织的基因表达谱、miRNA表达谱和DNA甲基化表达谱，发现OA睾丸组织的基因表达和表观遗传组数据(miRNA和DNA甲基化)与NOA明显不同。 2.对差异表达基因和差异表达miRNA进行了关联分析，构建了miRNA-基因调控网路，软件预测和实验验证结果都证明PLCXD3与miR-34c-3p，ZCCHC13与miR-369-3p有负调控关系。 3.在小鼠、OA和NOA的睾丸组织中检测了PLCXD3和ZCCHC13蛋白定位，首次发现小鼠和OA患者（生精功能正常）的睾丸有PLCXD3和ZCCHC13蛋白的强免疫阳性信号，而在NOA睾丸组织中表达非常弱;正常肝脏组织的PLCXD3和ZCCHC13基因的表达水平都非常低。 4.对差异表达基因和差异表达DNA甲基化位点进行了关联分析，发现ZCCHC13基因启动子存在甲基化修饰位点，甲基化转移酶抑制剂诱导的去甲基化能上调其mRNA和蛋白的表达。 5.ZCCHC13基因启动子DNA低甲基化修饰是肝细胞癌(Hepatocellularcarcmoma，HCC)组织和细胞系过表达ZCCHC13蛋白的表观遗传原因，而ZCCHC13过表达能激活AKT/ERK/c-MYC信号通路，上调周期蛋白CDK1和CKD4蛋白表达，进而促进肿瘤细胞增殖。 综上所述，本课题以睾丸组织为样本建立了芯片联合分析的方法，应用该方法筛选得到了两个关键基因PLCXD3和ZCCHC13，以及分别对应的靶miRNA:miR-34c-3p和miR-369-3p。此外，在生殖细胞和肿瘤细胞中发现ZCCHC13表达水平受DNA甲基化修饰的影响，基因组的去甲基化可以上调ZCCHC13蛋白表达。本研究首次在生殖细胞和肿瘤细胞中揭示了PLCXD3和ZCCHC13的表观遗传调控方式，为探索无精症和癌症的分子机制提供了重要的实验依据。
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