摘要
黄萎病是危害棉花的主要病害之一，严重影响棉花产量和纤维品质。陆地棉（Gossypium hirsutum）和海岛棉（G.barbadense）是世界上最大的两个栽培种，其中陆地棉表现产量高、适应性强特性，但对黄萎病缺乏免疫或高抗特性，海岛棉具有对黄萎病免疫、高抗且品质优良的特性。因此，从海岛棉中分离鉴定抗黄萎病相关基因并研究其功能对于棉花抗病分子育种具有重要意义。 本课题组前期对黄萎病诱导下的海岛棉Pima90-53全长cDNA文库进行了抗黄萎病基因的挖掘，获得了一个未知功能基因，命名为Gb VWR1(VWR=Verticillium wilt resistance)，并初步证实该基因参与棉花抗黄萎病反应。为了进一步研究GbVWR1在棉花抗黄萎病中的功能，本研究将该基因转入拟南芥进行超表达，并进行抗病性鉴定，从生理生化、分子生物学等方面对该基因的抗病机制进行解析;本课题组前期构建了黄萎病菌诱导的海岛棉酵母双杂交cDNA文库，通过酵母双杂交系统筛选GbVWR1互作蛋白，并通过对互作蛋白的分析，探讨其介导的抗病机制。本文主要研究结果如下: 1.构建了GbVWR1的超表达载体并转化拟南芥，获得了转基因拟南芥纯合株系。半定量RT-PCR以及Western Blot结果表明，目的蛋白已经在拟南芥中成功表达。病情指数(DI)分析显示，较野生型相比L1(DI)降低了24％，L2(DI)降低了25％，L3(DI)降低了27％。进一步进行差异性显著分析显示，超表达GbVWR1的拟南芥植株病情指数均显著低于野生型对照，表明超表达GbVWR1能够显著提高拟南芥对黄萎病抗性。 2.在接种黄萎病菌后12h和24h时，转基因拟南芥H2O2的含量呈上升趋势且显著高于野生型;POD活性显著高于野生型拟南芥，但是接菌后24h时转基因拟南芥与野生型拟南芥POD活性差异不显著，由此推测GbVWR1通过影响H2O2含量和POD活性，从而提高植株抗性。 3.RT-PCR结果显示，转基因拟南芥SA途径的标志基因EDS1和NDR1基因的表达量始终高于野生型拟南芥并且受黄萎病菌诱导后都上调表达。而NPR1、PR1、PR5的表达量均始终显著低于野生型。且受黄萎病菌诱导后，转基因拟南芥中三个基因均下调表达。这说明GbVWR1可能在调动SA信号途径的调控时，引起SA大量积累，但是过量的SA积累可能又抑制了SA-NPR1-PR分支。转基因拟南芥的JA、ET和芸苔素信号途径中的标志基因的表达量均始终显著高于野生型，并且受黄萎病菌诱导后，转基因拟南芥JA途径的标志基因PR4和ET信号途径的标志基因ERF1均下调表达。JA/ET信号途径基因PDF1.2和芸苔素(brassinosteroid，BR)信号途径的标志基因BAK1均上调表达。综上表明GbVWR1通过调动多条激素信号通路而使植物表现出抗病。 4.构建了GbVWR1的诱饵载体并转化酵母感受态细胞Y2HGold，经验证无毒性及自激活性后与酵母双杂交cDNA文库杂交，共获得24个与GbVWR1互作的蛋白，包括ABC转运蛋白家族的ABCG36，调节乙烯信号转导途径并参与乙烯合成的ACO3（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase3），参与水杨酸介导的植物防卫反应的GH3（Indole-3-acetic acid-amido synthetase）等。 5.酵母体内互作验证结果表明，携带pGBKT7-GbVWR1和pGADT7-ABCG36质粒的酵母杂交后在QDO/X/A不仅能够正常生长而且菌落能够变蓝，表明ABCG36与GbVWR1之间发生了蛋白互作，据此推测GbVWR1可能作为一种分子伴侣，通过激活类似于ABCG36这样大的蛋白质分子参与植物抗病反应。 综上结果分析表明，GbVWR1参与棉花抗黄萎病反应过程，并且是一个重要的正调控因子，可能通过与多个蛋白之间的互作调动了多条抗病信号通路。
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