摘要
目的:应用5×FAD转基因小鼠作为阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）小鼠模型，给予开心散(Kai-xin-san，KXS)、开心散加味新方(novel ModifiedKai-xin-san，MKXS)治疗，盐酸多奈哌齐(Donepezil hydrochloride，DP)作为阳性药物对照组，通过旷场实验(Open field test，OFT)、新物体识别实验(Novelobject recognition，NOR)、T迷宫实验(T maze，TM)、Y迷宫实验(Ymaze，YM)、Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)等行为学实验，研究药物对AD小鼠学习记忆能力的影响，评价开心散与开心散加味治疗AD的效果;采用westernblotting技术，检测小鼠海马APP剪切产物C99、突触后骨架蛋白PSD-95表达水平，分析不同组药物对海马突触蛋白的影响;采用低温冷冻透射电子显微镜技术，观察不同给药组小鼠海马CA1区突触前和突触后结构的差异;采用离体脑片膜片钳技术记录小鼠海马脑片CA1区长时程增强效应(Long-term potentiation，LTP)，比较不同组别间突触功能的差异，分析学习与记忆能力与突触结构和功能关系。探讨开心散原方与加味新方疗效区别及其对AD治疗作用的可能机制。 方法:取3～4月5×FAD小鼠，雌雄各半，随机分为4组，按照成人等效剂量分别给予双蒸水(5×FAD组)、Donepezil(5×FAD+DP组)、开心散（5×FAD+KXS组）、开心散加味新方（5×FAD+MKXS组）。另取同月龄野生型C57/BL6小鼠，灌胃双蒸水作为正常对照组（WT组）。灌胃给药3个月后，开始检测小鼠的OFT、NOR、TM、YM和MWM等行为学指标。行为学结束后，取材小鼠海马，western blot检测小鼠海马中APP剪切产物C99、PSD-95蛋白水平的表达，比较给药后小鼠海马中APP剪切产物C99和PSD-95蛋白水平的变化;戊二醛固定，取材小鼠海马CA1区脱水树脂化后切片，低温冷冻扫描电子显微镜观察各组给药后突触结构的变化;离体脑片膜片钳技术进行电生理记录，比较给药后对5×FAD小鼠海马CA1区Schaffer通路的LTP的影响。 结果:与WT组比较，5×FAD组小鼠在行为学检测中，NOR中新物体的探索时间，TM、YM中新奇臂探索时间，MWM实验目标象限停留时间和平台穿越次数减少，训练时逃避潜伏期(Escape latency)增大，结果表明5×FAD小鼠学习记忆能力较正常小鼠明显下降;给药后，与5×FAD组比较，多奈哌齐组、开心散组、开心散加味组均能使5×FAD小鼠在NOR中的新物体探索时间，T/YM中新奇臂探索时间，MWM实验中目标象限停留时间、平台穿越次数升高，训练时逃避潜伏期减少，结果表明给药后开心散和开心散加味均能够改善5×FAD小鼠的学习与记忆缺陷，且MWM中开心散加味新方改善小鼠记忆能力的效果优于开心散。WB实验表明5×FAD组小鼠APP剪切产物C99蛋白水平较高，突触后致密物PSD-95水平降低;电镜结果表明5×FAD组小鼠突触前突触小泡平均直径较大，数量较少，突触后区域较小;在电生理实验中，给予相同刺激情况下，5×FAD小鼠诱导的fEPSP幅度较小，LTP最后10分钟的稳定刺激幅度较小，这些结果说明5×FAD组小鼠突触的结构受到损伤，突触功能也相应受到损伤，与学习记忆能力的下降一致。而给药后WB实验发现小鼠海马区域APP剪切产物C99水平下降，PSD-95水平上升;扫描电镜观察到小鼠海马区域突触前突触小泡平均直径减小，数目增多，突触后区域增大，突触内线粒体结构更清晰完整，表明给药后抑制APP剪切产物C99生成，从而降低Aβ的产生，减轻突触结构的损伤，保护突触结构的完整性，且开心散加味新方保护突触结构的效果优于开心散原方。进一步的电生理实验中，给药后各组小鼠LTP最后10分钟的稳定刺激幅度增大，表明突触可塑性提高，突触功能得以维持，且开心散加味新方效果优于开心散原方。 结论:开心散原方和开心散加味可能通过抑制APP剪切产物C99生成，从而降低Aβ的生成，提高突触后PSD-95的表达，减轻Aβ对突触结构的损伤，保护突触结构的相对完整来维持突触功能的正常，改善5×FAD小鼠学习与记忆缺陷，且开心散加味新方效果优于开心散原方。
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