摘要
着丝粒作为染色体的一个核心组分，在细胞分裂过程中控制染色体的分离从而决定遗传物质的均等分配。着丝粒的形成(speciation)受到表观遗传调控。CENH3(也称CENP-A)是组蛋白H3的一种变体，是绝大多数真核生物功能着丝粒的一个表观遗传学标记。CENH3同时也是招募动粒蛋白组装动粒初始阶段的核心蛋白。着丝粒区CENH3核小体的复制依赖于CENH3蛋白在细胞周期中的精确定位。本论文对玉米中CENH3的定位机制进行了探讨。玉米中过量表达N端融合GFP的CENH3蛋白不能诱发在非着丝粒区域形成新着丝粒，原因可能是由于转基因的GFP-CENH3融合蛋白在细胞体内被大量降解。通过构建CENH3蛋白氨基酸序列不同类型的点突变及缺失突变，利用玉米原生质体瞬时转化体系、农杆菌介导的瞬时和稳定转化体系，对CENH3各个突变型在着丝粒区的定位进行了详细的研究。研究结果表明:CENH3蛋白的C末端尾巴(C terminal tail)对着丝粒区的核小体的组装至关重要。N端序列对CENH3的定位不是必要的，HFD(histone fold domain)能够介导CENH3定位到着丝粒区。Loop1区域的酪氨酸位点对CENH3的定位非常重要。此外，通过酵母双杂交筛选到两个和CENH3蛋白的HFD区特异互作的蛋白MCM7和NTFY，这两个蛋白可能参与调控CENH3蛋白在着丝粒区的定位。 本论文同时建立了利用CRISPR/Cas9系统对玉米进行基因组编辑的技术。基于35S启动子驱动Cas9蛋白表达的CRISPR/Cas9系统获得了具有突变表型的植株以及杂合的突变植株，并通过原生质体瞬时表达研究了CRISPR/Cas9系统对玉米异染色质区域的靶位点编辑活性。另外，筛选到玉米dmc1基因的启动子构建了DPC CRISPR/Cas9系统，运用该系统在玉米中意外实现了高效的基因组编辑。对于zb7基因的靶位点，通过农杆菌转化获得的转基因阳性愈伤都能再生获得纯合或双等位突变的植株，纯合或双等位突变在总再生植株中的比例达65.8％。对于编码同源染色体联会复合体蛋白的zyp1和另一个维持染色体结构的基因smc3进行编辑，也检测到了高比例的突变体发生。此外，对转基因T0和T1代的植株进行遗传分析表明利用DPC CRISPR/Cas9系统产生的突变alleles可以稳定传递到下一代，同时也能对T0代转基因植株的配子或受精卵进行高效率的编辑。全基因组重测序分析显示该系统的脱靶频率极低。
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