摘要
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PED virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高死亡率为特征的一种高度接触性肠道传染病。2010年以来，我国多地暴发的由变异毒株引起的PED，给养猪场造成了巨大经济损失。以CV777减毒株为代表的活疫苗在临床应用较为普遍，导致实验室诊断中无法快速区分野毒株与疫苗株。ORF3基因是PEDV的辅助基因，其部分片段的缺失可导致PEDV毒力减弱，也是鉴别PEDV强、弱毒株的重要靶标。本研究以ORF3为靶标，旨在建立鉴别PEDV强、弱毒株的TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan FQ-PCR)方法，为PED的诊断与防治提供重要技术支持。 分别以PEDV CV777减毒株和变异强毒株(HBQY)的核酸序列为模板，应用RT-PCR技术扩增PEDV ORF3全基因序列，回收的目的片段分别与pET-28a载体连接，构建了重组质粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3。应用PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ核酸内切酶消化以及序列分析对构建的重组质粒进行鉴定，证明构建的两个重组质粒内含有变异强毒株和减毒株的ORF3全基因。 根据CV777减毒株和强毒株ORF3基因序列的差异，设计一条鉴别强弱毒株的TaqMan探针引物及一对特异性PCR用引物，以重组质粒pET-28a-QY-ORF3和pET-28a-CV777-ORF3为模板，通过优化反应条件，确立反应体系，建立了相应的标准曲线，获得了特异检测PEDV强毒株的Real-time PCR标准曲线和直线回归方程，而不能检测到PEDV减毒株核酸。对扩增的核酸片段进行序列测定，结果扩增片段与已知序列完全一致。建立的TaqMan FQ-PCR方法最低能检测到3.7拷贝的病毒核酸以及7.96个TCID50的病毒，与猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪瘟病毒等无交叉反应。当扩增阈值(Cq值)＜36时，结果判定为阳性;若Cq≥36，则判定为阴性，批间重复性试验的变异系数小于2.46％。进一步应用建立的TaqMan FQ-PCR检测了38份腹泻仔猪的小肠及其内容物、肠系膜淋巴结等样品，同时将待检样品接种到Vero细胞上，连续盲传3代后，用间接免疫荧光方法(IFA)检测PEDV。结果TaqMan FQ-PCR与IFA的PEDV阳性检出率分别为31.58％(12/38)和26.32％(10/38)，表明前者的敏感性高于后者。上述结果表明，基于PEDV ORF3基因建立的TaqMan FQ-PCR能够特异、敏感地快速鉴别检测PEDV强毒株，可以为PED的快速检测与防治提供重要技术手段。
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