摘要
全球75％以上的人口医疗卫生保健需要依赖于植物来源的天然产物。传统的天然产物生产主要靠植物提取或化学法合成。随着基因组学大数据挖掘与合成生物学的不断进步，构建合成植物天然产物的微生物细胞工厂，突破传统生产方式，成为解决重要天然产物规模化生产的新的思路。本课题主要围绕着灯盏花来源的治疗心脑血管疾病的特效药物灯盏花素（主要包括灯盏乙素和少量灯盏甲素）的生物合成开展系统研究，借助生物信息学与合成生物学方法，构建合成灯盏花素的酿酒酵母细胞工厂，重点解决关键酶的挖掘、合成途径的构建、代谢工程改造以及发酵优化等问题。具体研究内容如下: 首先，根据灯盏花基因组测序和转录组测序结果，筛选出灯盏花来源表达量最高的芹菜素合成相关基因，并利用前期开发的M2S基因组装方法构建产芹菜素的酿酒酵母底盘细胞。随后通过生物信息学分析和分子克隆技术从灯盏花基因组中挖掘到了参与灯盏花素合成的黄酮7-糖基转移酶(F7GAT)基因和UDP-葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)基因。之后，根据近缘物种代谢物分析和P450基因的进化关系及表达分析，筛选到具有催化芹菜素6位羟基化功能的P450酶F6H。将上述外源基因在产芹菜素酿酒酵母底盘细胞中进行异源表达，首次实现了灯盏乙素和灯盏甲素在酿酒酵母中的从头合成。 其次，为了进一步提高灯盏乙素的合成效率，本研究还重点分析了关键限速酶的三维结构和催化机理。通过对半枝莲来源的与灯盏花来源的两类F6H进行同源建模和分子对接，结果表明虽然两者蛋白序列结构相似度只有31％，但是空间结构相似度极高。随后，通过定点突变的方法找出两类F6H催化黄酮6-羟化反应的关键位点。这项工作将为下一步进行酶改造，提高酶活性，提供指导意义。 另外，本研究还通过对前体物质丙二酰-CoA合成途径的优化，使得灯盏乙素的摇瓶发酵产量提高了1.68倍，达到15.5mg/g DCW。最终，通过发酵罐分批补料发酵使得灯盏乙素的最高产量达到108mg/L，灯盏甲素达到185mg/L。 综上所述，本项研究提出了一种利用微生物异源合成灯盏花素的生产方式，很有可能将灯盏花素的生产路线由传统的农业种植转变为规模化的工业发酵，大幅降低其生产成本。本研究不仅为治疗心脑血管疾病特效药物的生产提供了一种替代方式，也为从成千上万种传统中草药中鉴定天然产物的生物合成路线和工业化生产提供了新的思路。
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