摘要
本研究采用细胞培养、DAPI和MDC染色、RNA干扰、荧光蛋白标记、Western blotting等细胞分子生物学方法和技术，以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象，综合研究了鱼藤酮对神经细胞自噬水平的影响，并深入探讨了鱼藤酮诱导神经细胞凋亡与自噬抑制的关系。结果如下: 1、鱼藤酮诱导神经细胞自噬抑制 PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染Ad-GFP-LC3的PC12细胞和小鼠原代神经元，以不同浓度鱼藤酮(0-1μM)处理24h，或用鱼藤酮(1μM)处理(0-24h)，观察细胞GFP-LC3puncta变化;Western blot分析Atg5、P62、LC3蛋白表达。结果显示:鱼藤酮以浓度和时间依赖地方式诱导细胞GFP-LC3puncta数量减少，以及LC3-Ⅱ减少和p62表达增加。提示:鱼藤酮引起神经细胞PD模型中自噬抑制。 2、鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡 PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染shRNA LC3-Ⅰ/Ⅱ、shRNA Atg5、shRNAGFP、Ad-GFP-LC3的PC12细胞，用不同浓度鱼藤酮(0-1μM)处理24h、或用雷帕霉素(0.2μg/ml)预处理2h后鱼藤酮(1μM)处理24h，MDC染色和GFP-LC3荧光拍照评估细胞自噬体变化，DAPI染色分析细胞凋亡，Western blot检测Atg5、P62、LC3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表达。结果显示:雷帕霉素逆转鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度降低和凋亡增加;下调LC3-Ⅰ/Ⅱ或Atg5强化鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度或GFP-LC3puncta数量降低以及调亡增加。提示:鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡。
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