重离子束诱变选育绿色木霉及其产纤维素酶的研究

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中文摘要：随着化石能源的日益枯竭和全球能源危机的加剧，可再生资源受到了广泛的关注。木质纤维素类材料作为地球上储量最丰富的可再生生物质资源之一，对其加以有效的利用可缓解全球能源危机。纤维素酶是一组能够高效水解纤维素并生成可发酵糖的复合酶系的总称，由于酶解反应过程条件温和，易于控制，对环境无污染等优点已被广泛地应用于造纸、纺织、酿酒、食品、饲料、环保等多个行业。但是目前纤维素酶的开发应用仍面临着诸多问题，主要表现在纤维素酶生产菌株的生产性能不佳、酶的水解能力低下、下游分离工作繁琐、生产成本高等问题，严重阻碍了纤维素酶行业的快速发展。所以，本论文主要采用了重离子束对绿色木霉孢子悬液进行辐照诱变以选育优良的纤维素酶生产菌株，并进行了高活性纤维素酶突变株的纤维素酶发酵工艺优化，同时应用形态工程学技术对绿色木霉突变株的菌丝形态及相关代谢进行了初步研究，以探讨发酵工艺和菌丝形态对纤维素酶活性的影响。主要研究结果如下: 1、重离子束辐照诱变绿色木霉及高活性纤维素酶突变株的筛选利用不同剂量的重离子束辐照绿色木霉My的孢子悬液，绿色木霉的重离子束辐照效应研究结果显示，重离子束辐照绿色木霉的半致死剂量为120Gy，辐照的剂量为400Gy时，孢子的存活率降至9.43％，正突变率在40Gy，160Gy时高于负突变率，分别为18.52％，24％，在160Gy剂量下有助于高活性纤维素酶菌株的筛选。重离子束辐照后，通过平板水解圈法初筛、24孔深孔板复筛和摇瓶发酵复筛，最终在160Gy的辐照剂量下筛选获得一株高活性纤维素酶突变株My160-5，该菌株在液体摇瓶发酵120h后，其滤纸酶活(FPA)和内切葡聚糖酶活(EG)均高于原始菌株。My160-5的FPA和EG酶活达到了532.81U/mL，875.15U/mL，与出发菌株酶活相比分别提高了20.54％，24.4％(P＜0.01);对突变株My160-5进行斜面传代培养9代，结果表明菌株的遗传稳定性良好。 2、绿色木霉高活性纤维素酶突变株My160-5的产酶发酵工艺优化为了提高优良生产菌株的纤维素酶活力，本部分实验以诱变获得的绿色木霉高活性纤维素酶突变株My160-5为研究对象，采用Plackett-Burman(PBD)实验设计和响应面分析法(RSM)，对生产菌株的纤维素酶摇瓶发酵工艺进行优化。结果显示利用Plackett-Burman实验设计从影响纤维素酶发酵的9个优化参数中筛选出了初始pH值、CMC-Na和蛋白胨三个显著影响因素，然后采用Box-Behnken(BBD)实验设计和响应面分析法进行后续优化，最终优化得到的纤维素酶最佳发酵条件为:CMC-Na11.25g/L，初始pH4.25，蛋白胨6.5g/L，装液量为20％，(NH4)2SO42.1g/L，KH2PO42g/L，Tween801ml，发酵温度30℃条件下发酵5天，在最优的发酵条件下，经过验证实验得到的最高滤纸酶活为628.36U/mL，相比原始发酵水平提高了17.93％(P＜0.01)。 3、绿色木霉高活性纤维素酶菌株液体发酵中的菌丝形态调控研究利用形态工程学技术，借助微粒在流场中的作用来研究绿色木霉菌株My160-5的菌丝形态对纤维素酶活性及菌体生长的影响。结果显示在添加了不同浓度的微粒后，绿色木霉菌株的菌丝形态发生显著变化，随着添加微粒浓度的增加菌球直径显著降低，在特定的菌球形态下FPA和EG酶活都显著提高。添加浓度为10g/L时，滤纸酶活和内切葡聚糖酶活与对照相比分别提高了17.1％和13.3％。此外，根据菌球直径随着添加浓度的变化规律拟合了菌球直径预测的数学函数模型，通过应用形态工程学技术和数学建模手段来定向地控制绿色木霉的菌丝生长形态及发酵产酶活性，为纤维素酶的生产提供新的思路。

作者：

董妙音

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关键词：

绿色木霉纤维素酶诱变选育重离子束发酵工艺菌丝形态

授予学位：

硕士

学科专业：

生物物理学

导师：

王曙阳

学位年度：

2018

学位授予单位：

中国科学院大学

语种：

中文

中图分类号：