摘要
糖尿病肾病(Diabetic kidney disease，DKD)既往亦称为DN(Dibetic Nephropathy)，是糖尿病全身微血管病变在肾脏的表现，是由于长期慢性高血糖导致的肾脏损害，其发病机制复杂，目前越来越多的研究发现肾小球足细胞自噬行为异常与糖尿病肾病的发病密切相关。本研究在前期对糖尿病肾病临床观察研究的基础上，采用导师张宁教授临床上治疗糖尿病肾病疗效显著的益肾颗粒，围绕足细胞自噬，从两条信号通路:PI3k/Akt/mTOR及LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，开展动物实验及细胞实验，两部分共同观察益肾颗粒对糖尿病肾病大鼠及益肾颗粒含药血清对MPC5足细胞的干预作用研究。 第一部分:益肾颗粒调控PI3k/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/Sirt1信号通路对糖尿病肾病大鼠的肾脏保护作用研究 目的:观察益肾颗粒对高糖高脂饲料喂养联合STZ小剂量腹腔注射诱导糖尿病肾病大鼠模型的干预作用，从PI3k/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/Sirt1信号通路探讨其可能机制。 方法:SPF级雄性Wistar大鼠105只，从中随机取10只为正常组，常规饲料饮食;其余95只采用高糖高脂饲料喂养联合STZ小剂量(30mg/kg)腹腔注射法诱导糖尿病肾病大鼠模型，将造模成功后的90只大鼠随机分为模型组，中药组（中药低剂量、中剂量、高剂量组）、西药组（二甲双胍组、缬沙坦组），每组均15只。造模成功后（即实验第10周）开始进行灌胃治疗，连续灌胃10周，期间每5周用代谢笼收集24小时尿，检测24小时尿蛋白定量，目内眦取血1ml检测血肌酐、尿素氮、空腹血糖、血脂。灌胃第10周末（即实验第20周末）处死，收集血液，检测肾功能、血脂、血糖，对肾脏进行HE、油红O、Masson、PASM染色，光镜及电镜下观察肾脏组织病理形态。Western blot检测PI3k/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/Sirt1信号通路相关蛋白。 结果:(1)与正常组相比，模型组大鼠血Scr、BUN、FBG、TG、TC、24小时尿蛋白定量均明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比，各给药组Scr、BUN、FBG、TG、TC、24小时尿蛋白定量均有所下降，其中以中药中剂量组降低明显，有显著性差异(P＜0.01)。(2)肾脏HE染色:与正常组相比，模型组出现肾小囊增大，肾小管局灶变性、萎缩，肾小球基底膜略增厚、系膜基质增生，且肾小球、肾小管均有脂肪变性。与模型组相比，各给药组病变减轻，以中药中、高剂量组改善更加明显。肾脏油红O染色:与正常组相比，模型组可见大量红色脂滴沉积;与模型组相比，中药组及二甲双胍组脂滴堆积减少。肾脏Masson染色:与正常组相比，模型组肾小囊增大，肾小球内可见蓝色纤维沉积，且肾小球系膜区扩大，系膜基质增生。与模型组相比，各给药组蓝色纤维沉积明显减少。肾脏PASM染色:与正常组相比，模型组肾小球基底膜增厚明显，系膜基质增生，肾小囊增大，炎性细胞浸润，部分肾小管上皮细胞空泡变性。与模型组相比，中药中、高剂量组基底膜增厚、系膜基质增生程度减轻。电镜下，与正常组相比，模型组出现明显的基底膜增厚，足突融合;中药组可以观察到明显的自噬小体增多。(3)Western blot结果示:PI3k/Akt/mTOR信号通路:与正常组相比，模型组PI3k、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显增高(P＜0.01);与模型组相比，各给药组相关蛋白均有所下降(P＜0.01)，其中以二甲双胍组、中药中剂量组下降尤为明显。LKB1/AMPK/Sirt1信号通路:与正常组相比，模型组LKB1、p-AMPK、p-Sirt1蛋白表达明显降低(P＜0.01);与模型组相比，各给药组相关蛋白均有所上升(P＜0.01)，其中以二甲双胍组、中药中剂量组升高尤为明显。 结论:益肾颗粒能够降低糖尿病肾病大鼠Scr、BUN、FBG、TG、TC、24小时尿蛋白定量等，可能通过调节PI3k/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，减轻糖尿病肾病大鼠肾小球基底膜增厚、系膜基质增生、肾小管空泡变性。 第二部分:益肾颗粒对糖尿病肾病大鼠肝胰及糖脂代谢的作用机制研究 目的:观察益肾颗粒对高糖高脂饲料喂养联合STZ小剂量腹腔注射诱导糖尿病肾病大鼠的肝脏、胰腺及糖脂代谢的作用机制研究。 方法:SPF级雄性Wistar大鼠70只，从中随机取10只为正常组，常规饲料饮食;其余60只采用高糖高脂饲料喂养联合STZ小剂量（30mg/kg）腹腔注射法诱导糖尿病肾病大鼠模型，将造模成功后的60只大鼠随机分为模型组，中药组（中药低剂量、中剂量、高剂量组）、二甲双胍组，每组均12只。造模成功后开始进行灌胃治疗，连续灌胃10周，测定大鼠体质量、肝脏重量、胰腺重量等，收集血标本进行相关检测，采集肝脏及胰腺组织，进行肝脏HE和油红O染色、胰腺HE染色，光镜下观察肝脏及胰腺组织病理形态。 结果:(1)血液检测:与正常组相比，模型组大鼠HbA1c、FBG、FIN、HOMA-IR均明显升高，HOMA-β、HOMA-IS明显降低，有显著性差异(P＜0.01);与模型组相比，中药组及二甲双胍组大鼠HbA1c、FBG、HOMA-IR均有所下降，FIN、HOMA-β、HOMA-IS增加，其中以中药中剂量组、二甲双胍组明显，有显著性差异(P＜0.01)。肝功能:与正常组相比，模型组大鼠ALT、AST均明显升高，有显著性差异(P＜0.01);与模型组相比，中药组及二甲双胍组大鼠ALT、AST均有所下降，其中以中药中、高剂量组下降明显，有显著性差异(P＜0.01)。血脂:与正常组相比，模型组大鼠TG、TC、LDL-c、HDL-c均明显升高，有显著性差异(P＜0.01);与模型组相比，中药组及二甲双胍组大鼠TG、TC有所下降，有显著性差异(P＜0.01)。(2)肝脏HE染色:与正常组相比，肝组织内可见肝细胞弥漫性胞浆疏松化，气球样变，肝细胞脂肪变性程度为3度，以大泡性脂肪变性为主，同时可见胞浆内微泡性小脂滴聚集，在肝小叶周边明显，中央区较轻。汇管区可见少量炎性细胞浸润。局灶肝细胞坏死。肝小叶界限不清、肝索结构紊乱。与模型组相比，二甲双胍组及中药各组可见到肝细胞脂肪变性程度减轻，未见明显肝细胞坏死及炎细胞浸润。肝脏油红O染色:与正常组相比，模型组可见大量红色脂滴，呈弥漫性脂肪变性;与模型组相比，各给药组脂肪变性均有所减轻。胰腺HE染色:与正常组相比，模型组胰腺形态明显缩小，胰岛数量和面积减少，残存的胰岛中胰岛β细胞数量减少，胰腺组织内散在分布脂滴空泡，部分可见重度脂肪变性。与模型组相比，中药及二甲双胍组胰岛细胞数量有所增加，且胰腺脂肪变性减轻。 结论:益肾颗粒可能通过调节糖脂代谢、减轻胰岛素抵抗，对糖尿病肾病大鼠肝脏、胰腺具有一定的保护作用。 第三部分:益肾颗粒含药血清通过调节足细胞自噬减轻高糖刺激下足细胞损伤的实验研究 目的:观察益肾颗粒含药血清对高糖刺激下MPC5足细胞自噬的调节作用 方法:通过体外高糖刺激足细胞，采用CCK8法及Western blot检测足细胞自噬及自身相关蛋白，筛选出35mmol/L高糖浓度刺激48小时为高糖模型组，采用益肾颗粒含药血清（15％最佳血清浓度）及二甲双胍含药血清进行干预。用Western blot法检测足细胞自身蛋白Nephrin、Podocin及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、P62的表达量。MDC、Lyso-tracker、DAPI染色观察各组足细胞自噬的改变。并且按照不同分组，在含药血清干预足细胞的同时分别予以自噬抑制剂3-MA及氯喹、自噬诱导剂雷帕霉素、AMPK抑制剂Dorsophormin2HCL(Compound C)、LKB1抑制剂Radicicol分别干预，Western blot检测Nephrin、Podocin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK、p-mTOR、p-Akt等蛋白的表达情况。 结果:(1)与对照组相比，模型组足细胞Nephrin、Podocin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK表达下降;p-mTOR、p-Akt、P62表达增高;与模型组相比，中药组Nephrin、Podocin、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK表达升高，P62、p-mTOR、p-Akt表达下降。(2)MDC染色:高糖刺激48小时后足细胞其自噬活性下降，荧光减弱，二甲双胍组及中药组都可以再次恢复足细胞自噬，故两种含药血清组荧光表达较高糖模型组增强。Lyso-tracker染色示:与对照组相比，模型组Lyso-tracker染色荧光活性减弱。与模型组相比，二甲双胍组及中药组Lyso-tracker染色荧光活性增强。DAPI染色示:与对照组相比，模型组出现DAPI的染色加深，可见高糖刺激下，足细胞亦发生凋亡。与模型组相比，二甲双胍组及中药组DAPI染色荧光减弱，凋亡小体减少。(3)透射电镜:正常组足细胞各细胞器结构清晰可见，有少量的自噬体。与正常组相比，模型组细胞高糖刺激后足细胞结构破坏明显，可见到许多大小不等未被降解的损伤的细胞器以及降解后散在的黑色颗粒物质的堆积。与模型组相比，中药组足细胞损伤程度较轻。 结论:益肾颗粒含药血清可以减轻高糖刺激下足细胞损伤，其可能是通过调节足细胞自噬发挥保护足细胞的作用。
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