摘要
血吸虫病是危害人民身体健康最重要的寄生虫病.日本血吸虫尾蚴经皮肤感染宿主,发育成熟的成虫定居在门脉—肠系膜静脉系统,产卵并形成虫卵肉芽肿以及继发肝、肺组织纤维化.在此过程中肠系膜淋巴结是肠腔内主要的引流淋巴结,在受到外界抗原刺激后能诱导其内的淋巴细胞活化、增殖和分化.Toll样受体(TLRs)表达在天然免疫细胞和T细胞上,是最特征性的模式识别受体(PRRs),它在病原体感染期间调节免疫反应方面发挥着重要的作用.然而,在病原体感染时,TLRs在T淋巴细胞的表达和对T细胞功能的影响方面的研究还比较少. 目的: 研究日本血吸虫感染C57BL/6小鼠肠系膜淋巴结T细胞中TLRs的表达水平及其对T细胞功能的影响. 方法: 1、动物感染模型建立:40只6-8周龄雌性SPF级的C57BL/6小鼠被随机分成正常对照组和感染组(20只),感染小鼠组通过腹部贴片法感染(40±5条)日本血吸虫尾蚴. 2、组织取材及制备单个细胞悬液:分别分离正常小鼠和感染小鼠的肠系膜淋巴结,拍照,后研磨制备成单个细胞悬液. 3、细胞表面分子的检测:制备肠系膜淋巴结单个细胞悬液,加入相应荧光抗体染色,使用流式细胞仪检测分析CD3+T淋巴细胞CD25、CD69、CD127表达情况. 4、TLRs mRNA的检测:调整细胞密度为5×106/ml,提取淋巴细胞的总RNA,将总RNA进行逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA),以此为模板利用设计好的引物进行PCR扩增,测定TLRs的mRNA含量变化. 5、T细胞TLR的表达:制备肠系膜淋巴结单个细胞悬液,经固定、破膜和穿孔,加入相应荧光抗体染色,使用流式细胞仪检测分析T淋巴细胞的TLR2、TLR3、TLR4的表达水平; 6、细胞培养上清液中细胞因子的含量:调整淋巴细胞密度为2×106/ml,加入TLR2/3/4/7受体激动剂(PGN、PolyI:C、LPS或R848)在加或不加抗CD3抗体的条件下体外培养72h,使用ELISA法检测IL-4和IFN-γ的含量. 7、胞内细胞因子的含量的检测:制备肠系膜淋巴结单个细胞悬液,经TLR2/3/4/7受体激动剂(PGN、PolyI:C、LPS或R848)和抗CD3抗体刺激1h后加入BFA,继续培养4.5h.经固定、破膜和穿孔,加入相应荧光抗体染色,使用流式细胞仪检测分析CD3+细胞中不同亚群(CD4+细胞、CD8+细胞)产生IFN-γ和IL-4的情况. 结果: 1、日本血吸虫感染小鼠后肠系膜淋巴结中淋巴细胞数的增加(22.54±5.90)×106明显高于正常小鼠(12.88±3.26)×106(P<0.01),CD3+T细胞绝对数目增加明显(10.54±1.90×106vs.9.13±0.79×106P<0.01). 2、活化分子CD69在感染小鼠的CD3+T细胞中的含量为31.87±9.58%,明显高于正常小鼠12.26±2.54%(P<0.01). 3、RT-qPCR结果表明,感染小鼠的肠系膜淋巴结中TLR3、TLR4和TLR7mRNA的表达水平较正常组高,且差别有统计学意义(P<0.05). 4、日本血吸虫感染后CD3+T细胞中的表达TLR3+和TLR4+细胞百分比含量明显比正常组的高(TLR3+:2.51±0.89%vs.1.24±0.19%;TLR4+:1.67±0.49%vs.1.03±0.25%),且差别有统计学意义(P<0.05). 5、感染小鼠组肠系膜淋巴结中CD127+细胞在CD3+T细胞中的含量(43.21±7.50%)显著低于正常对照组(P<0.05).CD127+CD3+细胞表达的TLR3和TLR4百分比含量均高于CD127-CD3+细胞,且有显著性差别(P<0.05). 6、单独用R848刺激后,感染组培养物上清液中IFN-γ和IL-4含量显著升高(P<0.05).单独用LPS刺激后,感染组细胞IFN-γ的含量也明显高于正常小鼠(P<0.05).R848、PGN、LPS、或PolyI:C在anti-CD3抗体的协同刺激下可明显诱导IFN-γ和IL-4的产生,感染小鼠明显高于正常小鼠(P<0.05). 7、感染小鼠的肠系膜淋巴结在anti-CD3抗体和TLRs激动剂共同刺激下IL-4+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的含量有所上升.在anti-CD3抗体存在的情况下,PGN和R848诱导CD4+T细胞中IFN-γ+细胞的含量明显升高(P<0.05). 结论: 日本血吸虫感染C57BL/6小鼠能诱导肠系膜淋巴结T细胞TLR3和TLR4的表达显著增加,TLR能够明显促进感染小鼠T细胞IFN-γ和IL-4的产生.
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