摘要
缺血性脑血管病是危害人类健康的主要疾病之一，其高发病率、高致残率及高死亡率的特点给社会和家庭带来了沉重的负担。近年来，随着社会老龄化速度加快及人们生活方式的改变，缺血性脑血管病的发病率呈逐年升高的趋势，且患病年龄趋近于年轻化。目前临床上对缺血性脑血管病治疗主要采用静脉溶栓法，但严格的3h治疗时间窗是急性静脉溶栓的主要障碍。因此，识别或探索新的治疗靶点成为该领域的主要任务和挑战。传统中药黄芪，属豆科草本植物，具有补气固表、敛疮生肌、活血化瘀、消肿止痛的作用，广泛应用于全身各系统疾病的治疗。目前，国内应用黄芪与其他药物配伍治疗脑血管病的研究比较常见，而单独应用黄芪的某个单体是一个新的探索。研究发现，黄芪甲苷作为黄芪的三大有效成分之一，对神经细胞具有明显的修复作用。细胞自噬广泛存在于真核生物中，对维持细胞内环境稳态具有重要的作用。自噬参与脑缺血这一过程是无可争议的，但关于自噬在脑缺血疾病中确切的功能和影响尚未达成共识。本实验采用改良线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，模拟临床缺血性脑血管病的病理生理过程，应用药物黄芪甲苷观察治疗效果及细胞自噬在疾病中的作用。 第一部分 黄芪甲苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响 目的： 探究黄芪甲苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。 方法： 采用改良线栓法模拟局灶性脑缺血再灌注损伤。选取健康清洁级雄性SD大鼠40只，随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、黄芪甲苷组和溶剂对照组。除假手术组外，其他各组缺血2h、再灌注24h。黄芪甲苷组于再灌注的同时腹腔注射黄芪甲苷20mg·kg-1，溶剂对照组腹腔注射相同体积的溶剂。根据Zea Longa评分标准对各组大鼠进行神经功能学的评分，挑选模型成功的大鼠；TTC法检测脑梗死体积；尼氏染色法观察大鼠大脑皮质区细胞形态学的变化；透射电子显微镜观察大脑皮质区细胞超微结构的变化。 结果： 假手术组未见神经功能缺损症状，脑梗死体积为零。与假手术组比较，其他各组均有一定的神经功能缺损症状、不同程度的神经细胞损伤，脑梗死体积增加(P＜0.05)；与脑缺血再灌注组比较，黄芪甲苷组可明显改善神经功能缺损症状、减轻神经细胞损伤、减小脑梗死体积(P＜0.05)，而溶剂对照组无明显变化(P＞0.05)。 小结： 黄芪甲苷可明显降低脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能学评分，大鼠神经功能缺损症状得到显著改善；减小大鼠脑梗死体积；改善神经细胞形态结构和细胞整体状态，细胞内尼氏体增多、染色加深；明显减轻细胞膜、核膜断裂、缺损状况，核内染色质较均匀，减轻线粒体肿胀程度。黄芪甲苷可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。 第二部分 黄芪甲苷对脑缺血灌注损伤大鼠自噬的影响 目的： 探讨黄芪甲苷对脑缺血灌注损伤大鼠自噬的影响。 方法： 选取清洁级雄性SD大鼠70只随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、溶剂对照组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组和自噬激活剂组。采用TTC染色法检测大鼠脑梗死体积；尼氏染色观察大鼠神经细胞形态学变化；透射电子显微镜观察细胞自噬现象；Werstern blot检测Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达量的变化。 结果： 假手术组无神经缺损症状，未出现脑梗死灶。与假手术组相比，脑缺血再灌注组出现明显的脑梗死灶，神经细胞坏死增多，透射电镜下可见典型的自噬小体，自噬标志蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达增加(P＜0.05)。与脑缺血再灌注组相比，黄芪甲苷组、自噬激活剂组可明显减小脑梗死体积，神经细胞有不同程度的恢复，自噬体的数量、Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达均增加(P＜0.05)；自噬抑制剂组脑梗死体积增大，神经细胞坏死严重，自噬体数量减少，Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达降低(P＜0.05)；溶剂对照组与脑缺血再灌注组无明显差异(P＞0.05)；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组脑梗死体积增加，神经细胞坏死增多，自噬体数量减少，Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达降低(P＜0.05)。 小结： 黄芪甲苷可增加脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织内自噬体数量，激活自噬，上调自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达，从而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，从而发挥神经保护作用。 结论： 1、黄芪甲苷可明显降低脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能学评分，大鼠神经功能缺损症状得到显著改善；减小大鼠脑梗死体积；改善神经细胞形态结构和细胞整体状态，细胞内尼氏体增多、染色加深；明显减轻细胞膜、核膜断裂、缺损状况，核内染色质较均匀，减轻线粒体肿胀程度。黄芪甲苷可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。 2、黄芪甲苷可增加脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织内自噬体数量，激活自噬，上调自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达，从而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，从而发挥神经保护作用。
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