摘要
文章推测：氢可作为一种重要的生理调节因子抑制高糖对血管的损伤作用,缓解糖尿病的血管并发症.本课题以糖尿病模型、胰岛素抵抗模型和非酒精性脂肪肝模型为研究对象,从糖和脂类的代谢、氧化应激、抗氧化信号通路等方面探讨了氢水对糖尿病血管病变的保护作用及其机理. 研究内容： 1.建立并验证大鼠糖尿病血管病变相关的动物模型 根据经典的大鼠糖尿病血管病变动物模型,使用SD大鼠建立糖尿病模型、胰岛素抵抗模型和非酒精性脂肪肝模型,通过检测组织病理、血糖血脂代谢等指标,验证模型构建成功,用于下一步实验. 2.氢水对大鼠糖尿病和胰岛素抵抗的治疗作用 胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要特征,利用第一部分建立的动物模型,我们对糖尿病大鼠和胰岛素大鼠动物进行持续8周的氢水处理,同时使用阳性对照药物吡格列酮和阴性对照,观察各组大鼠的血糖、血脂、胰岛素敏感性和氧化应激等的影响,探索氢水对糖尿病和胰岛素抵抗大鼠的保护作用. 3.氢水对非酒精性脂肪肝的防护作用 非酒精性脂肪肝和糖尿病都涉及胰岛素抵抗,本部分研究氢水长期处理对模型导致的肝细胞组织结构的破坏,肝细胞凋亡情况,以及糖类、脂质的代谢情况,胰岛素的敏感性,糖耐量等影响,初步研究氢水对非酒精性脂肪肝模型大鼠的保护作用. 4.氢水对糖尿病血管病变防护作用的分子机制探讨 最后研究氢水对炎性细胞因子、细胞凋亡蛋白、氧化损伤产物等信号通路相关蛋白的影响,以及对PPARα和PPARγ的调控作用,初步探讨了氢水保护糖尿病血管病变的分子机制. 研究方法： 1.氢水的制备：使用商品化生理盐水袋,排出所有空气后,充满氢气,然后用高气压设备进行加压.制备好的氢水保存于4度,为了保证氢的浓度,氢水需每周新鲜制备一次. 2.大鼠糖尿病模型的建立： 8周龄的大鼠高脂、高糖饮食4周后,连续腹腔注射链脲霉素,25mg/kg.建立2型DM模型,通过测量空腹血糖来评价模型构建成功. 3.大鼠胰岛素抵抗模型的建立： 通过高糖、高脂饮食,诱导IR模型,8周后,OGTT测试和检测血糖水平.用大鼠胰岛素测量试剂盒测量空腹胰岛素,计算胰岛素敏感指数和稳态胰岛素抵抗来确认模型建立成功. 4.大鼠非酒精性脂肪肝疾病模型的建立： 腹腔注射链脲霉素,然后给予高糖、高脂饮食8周,通过口服胰岛素耐受测试,和测量餐后2小时血糖水平,来确认模型构建成功. 5.实验分组与处理：各组大鼠分为：对照组,模型组,模型+氢水组,每组10只. 6.血糖血脂检测：使用全自动生化分析仪检测. 7.氧化相关指标检测：按试剂盒操作说明书,使用SOD,GSH,MDA试剂盒检测;3-NT和8-OHdG用免疫组化方法染色,然后对切片进行分析. 8.大鼠肝脏组织凋亡检测：使用TUNEL染色试剂盒检测. 9.Caspase3活性检测：用Caspase3活性检测试剂盒检测. 10.大鼠肝脏组织结构变化：使用HE染色切片观察病理变化,根据Knodell肝脏组织学评分标准进行组织学评分. 11.PPAR表达的检测：使用免疫组化染色方法检测各组大鼠肝脏PPARα,PPAR?的蛋白表达情况;使用实时荧光定量PCR法检测mRNA的表达情况. 12.统计学分析：用SPSS11.0软件进行,两组比较,采用t检验;多组比较采用方差分析+SNQ t检验. 实验结果： 1.氢水对胰岛素抵抗大鼠、糖尿病大鼠和NAFLD大鼠的血糖、血脂的影响 在胰岛素抵抗大鼠模型、糖尿病大鼠模型和NAFLD模型中,我们均发现,氢水处理可以明显降低FBG的水平,而对2h PG没有明显影响,对大鼠体重也没有明显影响.我们还发现,在氢水处理组,TC,TG,LDL的水平明显低于生理盐水组,这一效果和吡格列酮处理相似,说明分子氢可能对体内的脂质代谢有一定的调控作用.但高密度脂蛋白没有明显的变化. 2.氢水对胰岛素敏感性的影响 在糖尿病和胰岛素抵抗模型中,我们发现氢水可以有效减低FINS,FBG,ISI和HOMA-IR的水平,说明氢水可以有效提高机体对胰岛素的敏感性;在NAFLD模型中,我们还通过观察胰岛素注射后不同时间血糖水平的变化,来检测大鼠对胰岛素的敏感性,发现模型组血糖持续保持高水平状态,而氢水组血糖明显降低,说明氢水可以提高胰岛素的敏感性,与胰岛素合用可以明显提升糖代谢,降低血糖水平. 3.氢水对氧化应激的影响 通过检测氢水对糖尿病大鼠和胰岛素抵抗大鼠的氧化应激反应,我们发现氢水可以有效提高抗氧化酶GSH和SOD的活性,减低脂质过氧化产物MDA的水平.说明氢水在抑制糖尿病所致的氧化应激损伤具有一定作用.另一方面,我们的研究发现,和对照组相比,NAFLD模型组3-NT和8-OHdG阳性细胞率明显升高,而氢水组显著降低了3-NT和8-OHdG阳性细胞数目,从氧化损伤产物的角度验证了氢水的抗氧化作用.这些发现均支持氢水在糖尿病、NAFLD等疾病相关动物模型中的强烈抗氧化作用. 4.氢水对NAFLD模型肝细胞组织结构和细胞凋亡的影响 为了观察氢水处理对NAFLD模型大鼠肝组织的整体保护效果,我们对各实验组肝组织进行了HE病理染色,发现高糖、高脂饮食诱导的模型组出现明显的肝细胞脂肪样变,肝细胞肿大,着色变浅,肝细胞内有明显脂滴沉积等病变;而氢水处理组肝脏组织、细胞结构明显优于模型组,说明氢水有效保护了高脂、高糖饮食导致的肝脏组织结构改变.肝脏病理评分也显示,分子氢有效降低了模型对肝病理结构的破坏.另外,我们用TUNEL法检测了对照组、模型组和氢水组肝细胞凋亡水平,发现模型组肝细胞凋亡率明显增高,而氢水组干细胞凋亡明显减少,同时发现氢水明显降低了肝脏Caspase3的活性. 5.氢水对炎性细胞因子的影响 研究者们在多种动物模型中证实,氢水具有抗炎的作用,可有效抑制炎性因子的分泌水平.我们发现NAFLD模型组大鼠血清中炎性因子TNFα,IL-1β明显上调,而在给氢组明显下调.另一方面,我们在上一部分发现了氢水能有效减轻NAFLD模型诱导的干细胞凋亡,为了进一步探索其分子机制,我们检测了caspase3活性,发现氢水可以明显降低模型组caspase3的活性的上调,说明氢水可能通过调节caspase3通路发挥抗凋亡作用. 6.氢水对PPAR信号通路的影响 我们用免疫组化和Realtime PCR的方法研究了氢水对PPARα、PPARγ蛋白和mRNA表达的影响,发现氢水可以显著增加PPARα、PPARγ阳性细胞的比例,增加其mRNA的表达量,但模型组和单纯对照组没有明显差异.说明氢水可能通过调节PPAR信号通路的作用,而发挥防治糖尿病血管损伤. 讨论与分析： 糖尿病血管病变是糖尿病并发症中主要致死因素之一,严重危害人类健康.大量的研究表明,其发病机制与氧化应激密切相关,如高糖导致线粒体能量代谢障碍而产生大量的细胞毒性自由基,自由基可以直接攻击血管内皮细胞而造成微血管或大血管的病变,也可以通过激活氧化损伤、炎性信号通路而造成胰岛β细胞的受损和胰岛素敏感性下降.近年来,随着2007年Ohsawa等报道了氢气的选择性抗氧化作用以来,推翻了氢气作为生理性惰性气体的医学常识,人们逐渐发现氢气在多种氧化应激相关疾病模型中具有重要保护作用.本研究中我们探讨了氢水对糖尿病血管并发症的保护作用,发现氢水可以有效降低三种模型中的空腹血糖水平、血脂水平,提高胰岛素的敏感性;提高机体内源性抗氧化酶GSH和SOD的水平,减少氧化应激产物MDA,3-NT,8-OHdG等;降低炎性细胞因子TNFα,IL-1β的分泌,下调凋亡效应分子caspase3的表达,从而减少NAFLD模型导致的细胞凋亡.最后我们还发现氢水对PPAR信号通路具有明显调控作用.以上研究结果表明,在糖尿病相关疾病模型中,氢水具有明显的抗炎、抗凋亡、抗氧化作用,这与氢防护很多慢性疾病中的研究结果相一致,但关于氢水作用机制仍不清楚.很多学者开始认为,氢水通过调控关键信号通路而发挥作用,并通过基因芯片的筛查检测到很多上调与下调的基因,本研究中,应用糖尿病疾病模型,我们发现氢水可以明显上调PPARα和PPAR的表达水平,而后者却在糖尿病血管损伤中具有重要作用. 结论： 氢水对糖尿病相关疾病模型,如糖尿病模型、胰岛素抵抗模型和非酒精性脂肪肝模型所致的机体损伤均有很好的保护作用.氢水可以有效降低三种模型中的空腹血糖水平、血脂水平,提高胰岛素的敏感性;提高机体内源性抗氧化酶的水平,减少氧化应激产物等;并且具有明显的抗炎、抗凋亡的作用.最后我们还发现氢水对PPAR信号通路具有明显调控作用.本研究明确了氢水在糖尿病及其血管并发症防治中的作用,并从以上方面对其机制进行了初步探讨,为氢水在糖尿病治疗中的临床应用提供了数据支持.
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