摘要
紫杉醇是临床上广泛使用的抗癌药物，主要从红豆杉植物中提取获得，但天然提取得到的紫杉醇远不能满足临床需求，寻求新的紫杉醇药源途径迫在眉睫，发展合成生物学技术是解决紫杉醇供需矛盾的重要途径。目前，紫杉醇生源路径中大部分酶的基因已被确认，但尚有母核上较多细胞色素P450羟化酶基因及其功能未被确认，尤其是母核上C1、C4和C9位对应的细胞色素P450羟化酶基因尚未发现，这是目前研究紫杉醇合成生物学技术的热点和难点。本课题基于中国红豆杉转录组数据，对红豆杉CYP450基因进行系统鉴定，通过功能注释及表达差异分析，挖掘紫杉醇生物合成相关的新的羟化酶候选基因，并通过基因克隆及功能研究进行候选基因的确认。取得的主要研究结果如下： 1）中国红豆杉CYP450基因的系统鉴定 基于中国红豆杉转录组数据，发现了118个全长和175个非全长的中国红豆杉CYP450基因。其中，除了5个基因（TcCYP725A1，TcCYP725A2，TcCYP725A4，TcCYP725A5，TcCYP725A6）被报道，以及另一个TcCYP725A3与已知的东北红豆杉的CYP725A3同源性达99%外，绝大多数CYP450基因都由本文首次发现。 获得的118个中国红豆杉全长CYP450经国际标准化分类和命名，被分为8个聚类（clan）和29个家族，同时被分为两个类别：A-type和non-A-type。其中，52个基因（44.1%）属于A-type（71clan），归属于11个家族，剩下的66个基因（55.9%）为non-A-type，分属于18个家族和7个clan。其中，在non-A-type中还发现两个新的CYP450家族，即CYP864和CYP947。 进化分析表明，中国红豆杉CYP450的遗传组成与裸子植物云杉较为一致，而与被子植物拟南芥、苜蓿等有较大差异。中国红豆杉CYP450s虽然高度分化成多个家族，但仍然有着结构上的保守特征，包括PFG element，PERF motif，K-helix region和I-helix region。 2）紫杉醇生物合成相关CYP450羟化酶候选基因的筛选 对鉴定到的118个全长中国红豆杉CYP450序列进行了功能注释。在Blast2Go中，这些CYP450s被划分为三大类：细胞组分（cellular component）、生物过程（biological process）与分子功能（molecular function），又具体分为21个功能组。将这118个CYP450s序列提交至Swissport，Nt，Nr，COG，GO，KEGG数据库中，使用BLASTX程序进行比对，阈值设为E<1e-5。结果表明，绝大多数CYP450s都得到了注释，其中有15个新的CYP725家族基因（从CYP725A9至CYP725A23）被注释到与紫杉醇生物合成相关。 对中国红豆杉CYP450s的表达差异分析发现，注释得到的15个新的CYP725家族基因中，TcCYP725A9,TcCYP725A11,TcCYP725A16,TcCYP725A20,TcCYP725A22和TcCYP725A23这6个基因的表达规律与已知紫杉醇合成羟化酶基因的表达规律一致且与紫杉醇合成量呈正相关，是最可能的与紫杉醇生物合成相关的候选羟化酶基因。 3）中国红豆杉TcCYP725A22和TcCYP725A23的克隆与酵母异源表达功能研究 选取两个候选羟化酶基因TcCYP725A22和TcCYP725A23进行克隆，同时克隆了已知的紫杉烷C2位羟化酶基因T2αH作为阳性对照。选用高拷贝、诱导型酿酒酵母表达载体pESC-TRP将这三个基因分别在WAT11中异源表达，Western blot结果表明，这几个目的蛋白均成功表达。 为了鉴定出紫杉醇母核上未知的羟化酶，以具有多个潜在羟化位点的紫杉素作为底物，与C2位羟化酶T2αH、候选羟化酶TcCYP725A22和TcCYP725A23分别进行反应。反应产物的HPLC检测结果表明，T2αH可以对紫杉素进行转化，结果与文献报道一致。候选羟化酶TcCYP725A22对底物紫杉素表现出催化活性，依据质谱结果及反应底物紫杉素的分子结构，判断催化产物很有可能为添加了两个羟基的紫杉烷新衍生物，而TcCYP725A23对紫杉素未见有明显的催化活性。 4）TcCYP725A22在中国红豆杉细胞体内的功能研究 鉴于体外反应进行羟化酶功能探究体系中的紫杉烷底物难以获得，将具有潜在羟化功能的候选基因TcCYP725A22在中国红豆杉细胞中进行过表达，分析转基因细胞中紫杉烷类代谢物指纹图谱的变化情况，确定候选羟化酶基因的催化位点。 结果发现，当TcCYP725A22基因过表达时，几个已知的紫杉醇合成相关的酶基因表达量也都有不同程度的上调；且细胞中各紫杉烷的含量普遍提高，其中H3T；decinnamoyl taxinine J；TC和TPT这4种物质的含量变化最为显着。综合分析这些物质的结构特点及酵母异源表达体外反应结果，可以判断TcCYP725A22最可能是一个新的C2位羟化酶基因。 以上研究为进一步确定紫杉醇生物合成路径中的未知羟化酶奠定了基础，有助于完全解析紫杉醇生源途径，促进紫杉醇合成生物学技术的全面创立。
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