摘要
杜仲（Eucommia ulmoides）是我国特有植物资源，药用历史悠久，含有多种天然活性成分，具有广泛的药理作用。但目前，杜仲资源多用于杜仲茶、饮品、食品、饲料添加剂等初产品的加工，缺乏市场竞争力。如何能将我国特有的丰富的杜仲资源物尽其用，发挥其最大的经济效益是我们现在的首要任务。为了推进我国杜仲产业的转化，加速其国际化进程，必须对杜仲活性成分进行精深加工，研发出一系列具有高附加值的产品，以增强其在国际市场上的竞争力，提高杜仲资源的社会和经济效益。 本论文以杜仲树皮和叶为原料，采用循环超声提取技术对京尼平苷进行有效提取，采用大孔树脂法纯化京尼平苷，及绿原酸等成分。合成磁载硅胶固定化碱性离子液体和磁载硅胶固定化纤维素酶催化剂，采用扫描电子显微镜、红外光谱、热重分析、元素分析和X-射线衍射对合成的催化剂进行表征。利用获得的磁载硅胶固定化碱性离子液体催化转化京尼平苷制备京尼平苷酸，利用获得的磁载固定化纤维素酶催化转化京尼平苷制备京尼平。通过大孔树脂法对转化产物进行富集制备，采用红外光谱及液相-质谱/质谱(LC-MS/MS)对纯化产物进行表征及鉴定。本文主要研究内容及结果如下: 1.建立了同时检测京尼平苷、京尼平和京尼平苷酸的高效液相色谱(HPLC)检测条件。检测波长为:240nm;流动相组成:甲醇-0.04％磷酸水溶液，比例为22∶78(v∶v)。3种组分在测定的浓度范围内呈良好的线性关系（R2≥0.9994）。 建立了同时检测京尼平苷和绿原酸的HPLC检测条件。检测波长为328nm。流动相组成确定为甲醇-0.1％甲酸水溶液，比例为32∶68(v∶v)。2种组分在测定的浓度范围内呈良好的线性关系（R2≥0.9992）。 建立了同时检测京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷的HPLC检测条件。检测波长为256nm。流动相组成确定为乙腈-水-冰乙酸，比例为15∶85∶1.5(v∶v∶v)。2种组分在测定的浓度范围内呈良好的线性关系(R2≥0.9996)。 方法学验证实验结果表明，本方法准确度高、稳定性好，适用于京尼平苷、京尼平、京尼平苷酸、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的定量分析，为杜仲活性成分的研究开发提供了高效、精确的分析方法。 2.采用循环超声法从杜仲皮中提取京尼平苷，通过实验确定了最佳的提取工艺条件。按照40mL/g的液料比将物料与40％乙醇混合，在40℃下，超声提取40min，超声功率为600W，搅拌速度为1500转/min。在此最佳工艺条件下，京尼平苷的得率为4.33±0.21mg/g，提取液中京尼平苷浓度为215.82±10.15μg/mL。 3.确定了循环超声法提取京尼平苷和绿原酸的最佳工艺条件。40％乙醇作为提取溶剂，按照50mL/g的液料比与一定量物料混合，40℃、1500转/min、400W的条件下超声提取20min。在最佳提取条件下，绿原酸得率为4.81±0.24mg/g，京尼平苷得率为0.48±0.02mg/g。通过静态吸附解吸实验，确定了最佳的富集分离京尼平苷和绿原酸的条件为:HPD600型大孔树脂;吸附4h;20％乙醇为洗脱剂;静态洗脱时间为30min。动态洗脱结果表明，在此条件下京尼平苷和绿原酸能够完全分离开。 根据杜仲树皮和叶片组织的不同特点，利用循环超声提取技术对目标成分京尼平苷进行提取，这一新型提取技术与以往的超声提取技术相比，具有高效、易工业放大等优势。 4.通过D101、DM130、HPD400A、HPD80、HPD600、HPD100B、ADS-7和ADS-17大孔树脂对京尼平苷的静态吸附-解吸实验，筛选出HPD600型树脂进行京尼平苷的富集，在25℃的条件下静态吸附3.0h，京尼平苷的饱和吸附量为402.37μg/g;然后10％的乙醇静态解吸附20min，解吸温度45℃，解吸率为94.38％。动态上样浓度为42.35±2.12μg/mL，上样流速为3BV/h，饱和吸附量为8BV，当用24BV的10％乙醇以2BV/h的流速洗脱时，京尼平苷回收率可达95.73％。经树脂纯化后，京尼平苷纯度由1.79％提高到41.25％。洗脱液减压浓缩，乙酸乙酯充分萃取浸膏中的京尼平苷，萃取液低温处理，得京尼平苷结晶;结晶经乙酸乙酯-丙酮室温洗涤除杂，得纯度为98.51％的京尼平苷晶体。红外光谱分析结果表明纯化后的产物红外谱图与京尼平苷标准品谱图高度吻合。采用LC-MS/MS分析了纯化产物，确定分离纯化的物质为京尼平苷。本方法获得的京尼平苷产品纯度高，为京尼平苷的后期实验研究打下了良好的基础。 5.通过将离子液体固定在经修饰的磁载硅胶颗粒上，合成了磁载硅胶固定化碱性离子液体催化剂。扫描电镜分析结果显示，磁载硅胶固定化离子液体催化剂呈球形，平均粒径为98.26nm。红外图谱解析结果表明，磁载硅胶固定化碱性离子液体具有Fe3O4和咪唑环的特征吸收峰;X-射线衍射结果显示负载离子液体的过程并没有对磁载硅胶的晶体结构造成破坏;能谱分析结果显示磁载硅胶固定化催化剂中含有N元素，证明离子液体已经负载在了磁载硅胶上。磁载硅胶固定化离子液体催化剂平均固载量为292.87±11.05mg/g。 确定了最佳合成磁载硅胶固定化碱性离子液体的原料比例。3.00g Fe3O4与800mL乙醇混合，混合物超声10min。向上述混合液中依次加入120mL水，60mL氨水和10mL正硅酸乙酯，室温搅拌反应5h。得磁载硅胶(Fe3O4@SiO2)。3.00g Fe3O4@SiO2和10mmol乙烯基三乙氧基硅烷混合，110℃油浴蒸馏反应24h。得修饰后的Fe3O4@SiO2颗粒(Fe3O4@SiO2@VTES)。3.00g Fe3O4@SiO2@VTES、1.50g带有咪唑基的离子液体([VHim]Im)和0.04g偶氮二异丁腈(AIBN)混合于35mL三氯甲烷中，室温搅拌反应1h。加热混合液至75℃以除去三氯甲烷，然后100℃反应2h，既得磁载硅胶固定化离子液体Fe3O4@SiO2@[VHim]Im。 确定了最佳催化转化京尼平苷的条件。40mg的Fe3O4@SiO2@[VHim]Im与2mL待水解液混合，在加热功率为300W的条件下反应3.0h。HPLC测得京尼平苷转化率为96.53％。同一份固定化离子液体重复使用5次，京尼平苷转化率在50％以上，重复使用效果良好。经DM130大孔树脂富集后，京尼平苷酸纯度从7.95％提高到了35.68％。洗脱液经减压浓缩得含京尼平苷酸的浸膏，甲醇复溶提取京尼平苷酸，甲醇-丙酮多次洗涤除杂，得纯度为95.67％的京尼平苷酸晶体。红外光谱及LC-MS/MS检测分析结果显示，经固定化离子液体催化转化京尼平苷所得产物为京尼平苷酸。 采用磁载硅胶固定化碱性离子液体为催化剂，具有催化效率高;催化剂可重复使用;从反应体系分离容易的特点。这一方法经文献检索尚未见报道。 6.通过将酶固定在经修饰的磁载硅胶颗粒上，合成了磁载硅胶固定化纤维素酶催化剂。扫描电镜分析结果显示，磁载硅胶固定化纤维素酶呈球形，平均粒径为99.21nm。红外图谱解析结果表明，该磁载硅胶固定化纤维素酶具有Fe3O4特征吸收峰，且在1094cm-1处有一特征峰，表明有组氨酸与铁的配位基;X-射线衍射结果表明负载酶的过程并没有对磁载硅胶晶体结构造成破坏;能谱分析结果显示磁载硅胶固定化纤维素酶催化剂中含有N元素，纤维素酶已经键合到了磁载硅胶上。磁载硅胶固定化纤维素酶的固载量为135.91±6.81mg/g。 确定了磁载硅胶固定化酶催化转化京尼平苷制备京尼平的最佳工艺条件。60mg的磁载硅胶固定化纤维素酶与2mL待水解液混合，在反应温度为50℃，pH为3.6的条件下反应8h。HPLC检测，京尼平苷转化率为97.58％，京尼平浓度为22.64μg/mL。催化剂重复使用5次，京尼平苷转化率仍大于55％。经HPD700型大孔树脂富集后，京尼平纯度从10.25％提高到了42.36％。洗脱液减压浓缩，经乙醚反复萃取，丙酮重结晶，低温干燥，京尼平纯度为97.38％。红外光谱及LC-MS/MS检测分析结果显示，磁载硅胶固定化纤维素酶催化转化京尼平苷所得产物为京尼平。 采用磁载硅胶固定化纤维素酶能定向催化转化京尼平苷制备京尼平，催化剂可重复利用，成本相对低廉，催化剂从反应体系分离便捷容易。这一方法，经查阅国内外文献，无相同报道。
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