摘要
我国地域辽阔，涝渍性土地分布广泛，滩地面积巨大，利用涝渍滩地发展人工林具有重要的经济价值与生态价值。杨树具有速生、耐水湿特点，是我国涝渍土地造林的首选树种之一。但淹水胁迫现象的发生，显著降低了涝渍地区杨树的木材产量，造成巨大损失。因此，研究杨树抗涝的分子生理机理并鉴定抗涝基因，对抗涝速生新品种的培育具有重要理论与现实意义。前期研究中，课题组以 I-69杨(Populus deltoids Bartr.'Lux'ex I-69/55抗涝）×小叶杨（P.simonii不抗涝〕的全同胞子代LS1(抗涝)与 LS2(不抗涝）为试材，通过淹水胁迫下细根的表达谱测序（RNS-Seq)，筛选出了差异表达基因 PtMYB194和 PtMYB177。为深入研究这两个候选基因的抗涝功能，本文采用 qRT-PCR方法进一步分析了 PtMYB194和 PtMYB177基因在LS1与LS2中的表达量；采用 Gatewaay方法克隆了这两个基因，并分别构建了其超量表达载体（OE）与 RNAi载体。同时，还建立了 LS1与 LS2的叶片再生与组培快繁体系，并采用农杆菌介导的叶盘转化法对 LS1进行了遗传转化，获得了PtMYB194和 PtMYB177基因少量的转基因阳性植株，为这两个基因后续的抗涝功能分析奠定了材料基础。 本研究主要内容包括：⑴构建了LS1和 LS2的组织培养体系，筛选出了其初代、增殖、生根以及叶片再生的适宜培养基。初代腋芽诱导培养基：MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。接种30d后LS1和LS2的腋芽萌发率均达到100％，且腋芽生长健壮。增殖培养基：MS+0.1mg/LNAA+0.3mg/L6+BA。接种30d后，LS1的增殖系数达到4.77，LS2的增殖系数达到5.08。生根培养基：1/2MS+0.5mg/LNAA+0.1mg/L1BA。生根培养30d后，LS1和 LS2的生根率达到100％。LS1叶片再生培养基：“MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+0.005mg/LTDZ。接种30d后，LS1的平均再生率达到100％，每个叶片外植体分化出4.42个芽。LS2叶片再生培养基：“MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+0.001mg/LTDZ。接种30d后，LS2的平均再生率达到92％，每个叶片外植体分化出5.91个芽。⑵PtMYB177在正常浇水的LS1的叶柄、叶片、茎、根中均有表达，表达量大小依次为根＞茎＞叶柄＞叶片。在LS2中的表达量与LS1相似。LS1淹水1d时，PtMYB177在根中被诱导表达，其表达量为正常条件下的1.49倍；淹水7d时，PtMYB177在根中的表达量被抑制，其表达量仅为正常条件下的0.62倍。PtMYB177在LS2中的表达量随淹水时间的变化趋势与LS1相似。淹水1d时，PtMYB177在根中的表达量为正常条件下的1.35倍；淹水7d时，PtMYB177的表达量仅为正常条件下的0.38倍。⑶PtMYB194在正常浇水的LS1的叶柄、叶片、茎、根中均有表达，表达量大小依次为根＞叶柄＞叶片＞茎。LS1淹水1d时，PtMYB194在根中被诱导表达，其表达量为正常条件下的0.96倍。淹水7d时，PtMYB194在根中的表达量被抑制，其表达量仅为正常条件下的0.09倍。PtMYB194在LS2中的表达量随淹水时间的变化趋势与LS1相似。LS2淹水1d时，PtMYB194在根中的表达量为正常条件下的4.42倍；淹水7d时，PtMYB194的表达量为正常条件下的157.6倍。⑷利用Gateway技术构建了 PtMYB177和 PtMYB194基因的超量表达载体(OE)与 RNAi载体，并通过农杆菌介导的遗传转化法转入LS1中，共得到PtMYB177.OE、PtMYB177、PtMYB194.OE、PtMYB194.RNAi的阳性苗各1株。
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