摘要
鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种寄生虫病，其分布范围广、防治困难、世界各地普遍发生，对集约化养鸡业的危害十分严重。迄今鸡球虫病主要是通过化学药物来进行防治，随之而来的是耐药性虫株的产生，肉蛋产品中药物残留，以及药物对机体的毒性强等问题。不仅如此每年因为药物防治及新药研制等造成的间接经济损失也是相当的惊人。为了避免这些问题，人们通过活疫苗接种的方式来预防鸡球虫病的发生。但由于鸡球虫的生活史复杂、不同虫株间的基因多样性等因素造成免疫失败，另外活疫苗的稳定性差，且不利于大规模生产等问题，影响了活疫苗的推广。近些年来，随着分子生物技术的不断发展，基因工程苗的优势逐渐显现，例如免疫原性好、毒性弱、生产成本低等。因此基因工程疫苗逐渐成为球虫学界的研究热点。鉴定和筛选鸡球虫的保护性抗原是目前鸡球虫病免疫防治的研究重点。有研究发现鸡球虫的表面抗原（ Surface Antigens， SAGs）是一种入侵相关蛋白( Invasion-Related Protein)，其在诱发宿主免疫应答的过程中发挥着重要的作用。有研究认为鸡感染艾美耳球虫后，表面抗原（Surface Antigens，SAGs）可激起宿主的保护性免疫应答，保护鸡的肠上皮细胞免受虫体的入侵。迄今对弓形虫SAGs的研究已经十分深入，但对艾美耳球虫SAGs的相关研究却相对滞后。目前只有少部分的SAGs被成功克隆与研究，如EtSAG2、EtSAG5、EtSAG10等。因此本研究克隆了EtSAG6和EtSAG15基因，随后对其进行了原核表达和真核表达，并用制备的重组蛋白和重组质粒进行免疫保护性试验，综合评价SAG6和SAG15基因的保护效力。 本研究主要内容包括：⑴通过NCBI数据库获取柔嫩艾美耳球虫SAG6和SAG15基因的相关信息并设计引物，扩增得到771bp的SAG6全长序列和792bp的SAG15全长序列。根据NCBI ORF Finder分析表明SAG6基因编码256个氨基酸；SAG15基因编码263个氨基酸。结构分析发现，SAG6和SAG15具有柔嫩艾美耳球虫SAG家族基因所特有的氨基酸结构特征，如N末端具有信号肽；C末端具有GPI锚定等。⑵扩增了不含N端信号肽和C端GPI锚定的SAG6和SAG15截短片段，并将SAG6和SAG15片段连接至原核表达载体pET-28a，将构建成功的重组质粒pET-28a-SAG6和pET-28a-SAG15转入大肠杆菌BL21菌中，经过IPTG诱导，实现其在宿主菌BL21中表达。表达时SAG6蛋白和SAG15蛋白均以包涵体形式存在于菌体细胞内，通过透析和浓缩，获得了纯度较好的目的蛋白，并通过Western-Blot进行验证。⑶扩增了不含N端信号肽和C端GPI锚定的SAG6和SAG15截短片段，并将SAG6和SAG15片段连接至真核表达载体pEGFP-N1，转化大肠杆菌DH5α菌，保菌、去内毒素提取质粒后，转染至293T细胞。通过荧光显微镜观察发现，重组质粒pEGFP-N1-SAG6和 pEGFP-N1-SAG15在真核系统中的成功表达，并通过Western-Blot和RT-PCR进行验证。⑷通过免疫保护性试验和ELISA检测血清中细胞因子的水平，综合评价基因的免疫保护力。具体方法是检测了ACI四个常用指标，包括OPG、存活率、相对增重率和盲肠病变记分，另外检测细胞因子IFN-γ/IL-4水平。分析发现各组的IFN-γ水平没有统计学差异，各组的IL-4水平也没有统计学差异。重组蛋白SAG6和重组蛋白 SAG15的抗球虫指数分别为149.81和132.75。重组质粒 pET-28a-SAG6和pEGFP-N1-SAG15的抗球虫指数分别为150.20和144.70。分析还发现，重组蛋白SAG6在增重保护方面具有较好的效果，重组质粒pEGFP-N1-SAG15在盲肠保护方面具有较好的效果。综合分析发现，重组质粒比重组蛋白的抗球虫效果要好。
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