摘要
壳聚糖由几丁质脱乙酰化后生成，在水中溶解度很低，不容易被人体吸收利用，因而限制了其应用。但其降解产物，如氨基葡萄糖分子已在药物、食品、化妆品农业等领域具有有良好的应用前景。目前，市场上的氨基葡萄糖多为浓HCL水解产物，但浓HCL具有很强的腐蚀性，且产品在后处理工艺复杂，因而该方法并不利于生产。本实验室前期研究中，已构建了壳聚糖酶重组菌株，可望发展氨基葡萄糖的酶法生产工艺。本文主要对该外切酶酶学性质、氨基葡萄糖酶解工艺优化、产品质量检测以及对骨关节损伤修复功能展开研究。 本研究主要内容包括：⑴外切酶酶学性质分析：研究表明，该外切壳聚糖酶的最适温度为60°C，pH为5.5。在50°C下分别处理1 h、11 h后，残余酶活为76%、58%；在55°C下处理1 h、11 h后，残余酶活分别为67%和26%，可见，该外切酶具有较好的热稳定性；金属离子Mn2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Ag+和EDTA对酶有抑制作用。⑵葡萄糖酶解工艺的优化：通过比较，确定采用复合酶解的方式生产氨基葡萄糖，即同步添加内切壳聚糖酶和外切壳聚糖酶。在单因素优化的基础上，以内切酶酶底比、外切酶酶底比、反应温度、酶解时间为变量，设计4因素3水平的正交实验，得到酶解的最佳条件是：内切酶酶底比20 u/g、外切酶酶底比35u/g、反应温度50°C、反应时间10h，此时氨基葡萄糖产率为79.42±1.054%。⑶氨基葡萄糖产品质量检测的结果：随机选取喷雾干燥后得到的某批氨基葡萄糖产品进行质量检测。氨基葡萄糖含量为80%，水分含量为8.36%，灰分1.36%，蛋白质含量为4.66 mg/mL,汞含量为0.0022 mg/kg，镉含量0.0081mg/kg，铅含量0.69mg/kg，铬含量14.9mg/kg，砷含量0.491mg/kg，符合相关国家标准的要求。⑷骨关节损伤修复功能验证：小鼠骨关节损伤建模成功后，灌胃氨基葡萄糖，动物实验结束后检测小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子含量的、C-反应蛋白（CRP）含量及抗体水平并对小鼠膝关节组织进行切片观察。结果表明，与模型组相比，给药组小鼠膝关节肿胀程度减轻，免疫器官指数，显著升高（P＜0.05）；血清CRP水平相对模型组显著下降（P＜0.05）；IL-2水平较模型组和对照组显著上升（P＜0.05）；细胞因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-6、IL-10水平与模型组和对照组相比显著降低（P＜0.05）；抗体IgA、IgM、 IgG水平与模型组和对照组相比显著升高（P＜0.05）。此外，血糖监测的数据表明，持续灌胃氨基葡萄糖并不会导致小鼠空腹血糖的升高。
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