摘要
菘蓝为多年生草本植物，其根为板蓝根，是中国应用历史悠久的传统中药材。菘蓝在黑龙江省人工栽培资源丰富，但是存在着与农作物种植相互争地的矛盾。此外，菘蓝生长周期较长(2-3年)，大田栽培很难满足其正常生长年限，致使菘蓝根药材中的主要活性成分（生物碱和黄酮类次生代谢化合物）含量往往过低。同时，菘蓝在大田栽培时易受到产地差异、气候变化、病虫害侵袭、土壤重金属和农药残留等诸多不利因素的影响，使得市场上所售菘蓝根药材品质良莠不齐，并造成了相关医药制剂临床治疗效果不佳等后果，已难以满足国内外市场日趋严苛的中药材质量要求。为解决上述问题，一条途径就是利用菘蓝根相关组织培养技术来代替传统大田栽培方式进行规模化生产药用次生代谢活性成分，另一条途径就是对菘蓝根中主要次生代谢活性成分的生物合成调控机制进行研究，以期利用基因工程技术高效生产目标活性成分。 基于以上所述，本项研究首先建立了能够精确定性和定量分析菘蓝根中主要生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的LC-MS/MS分析方法，并利用该方法对菘蓝毛状根中目标活性成分的灵敏追踪为导向，建立了一个稳定高产生物碱和黄酮类活性成分的菘蓝毛状根培养体系，用以作为生产目标活性成分以及研究其相关生物合成调控机制的模式平台。其次，利用外源理化和生物诱导子胁迫处理菘蓝毛状根培养体系，并以目标次生代谢活性成分积累量为指标，优化并确定不同诱导子胁迫处理的最佳条件。最后，利用现有菘蓝基因资源和已报道的转录组测序数据进行深入挖掘和分析，筛选出参与生物碱和黄酮类活性成分生物合成路径的候选酶基因，通过分析系列诱导子胁迫处理菘蓝毛状根前后目标活性成分含量的变化规律，并结合目标活性成分生物合成候选酶基因的表达差异性规律，以期初步明确菘蓝毛状根中调控生物碱和黄酮类活性成分生物合成的潜在关键酶基因。本论文的主要研究内容及结果如下: 1、建立了分析检测菘蓝根中主要生物碱和黄酮类活性成分的LC-MS/MS方法 (1)分析检测6种生物碱类次生代谢活性成分的LC-MS/MS条件如下: 色谱条件:Phenomenex Gemini C18110A反相高效色谱柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm);流动相体系为乙腈(A)和水溶液(B);梯度洗脱流程为0-8min45-55％(A)，8-9min55-85％(A),9-14min85％(A),14-15min85-45％(A),15-17min45％(A);柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。 质谱条件:电喷雾负离子电离模式;最佳SRM条件下目标化合物离子对分别为表告依春m/z127.8→58.0，靛红m/z145.6→118.0，吲哚-3-甲醛m/z143.9→115.1，色胺酮m/z247.2→218.9，靛蓝m/z261.0→217.0，靛玉红m/z261.2→157.0。 (2)分析检测8种黄酮类次生代谢活性成分的LC-MS/MS条件如下: 色谱条件:Phenomenex Gemini C18110A反相高效色谱柱(250mm×4.6mm I.D.，5μm)，流动相体系为乙腈(A)和0.001％甲酸水溶液(B);梯度洗脱流程为0-5min40-50％(A),5-13min50-60％(A),13-15min60-68％(A),15-16min68-40％(A),16-18min40％(A);柱温为30℃，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。 质谱条件:电喷雾负离子电离模式;最佳SRM条件下目标化合物离子对分别为芦丁和新橙皮苷m/z609.3→301.4，蒙花苷m/z591.4→283.1，甘草素m/z255.9→119.0，槲皮素m/z301.0→151.0，异鼠李素m/z315.0→300.1，山奈酚m/z285.3→183.1，异甘草素m/z255.4→118.9。 利用上述两种LC-MS/MS分析检测方法，既能够有效摒弃其他非目标杂质成分的干扰，又能够快速、灵敏和精确的定性和定量检测菘蓝根中14种目标次生代谢活性成分，适用于对后续菘蓝毛状根中痕量级目标次生代谢活性成分的分析检测。 2、建立了菘蓝毛状根体外诱导转化体系及高产生物碱和黄酮的液体培养体系 (1)选取3周龄菘蓝无菌苗叶柄为外植体，经发根农杆菌LBA9402侵染后在含有125μM乙酰丁香酮和1.5mM精氨酸的1/2MS培养基上共培养2天，转移到含有300mg/L头孢噻肟钠的抑菌培养基中进行除菌处理，最终毛状根诱导率可达76.67％，且整个诱导周期仅需16天;同时以毛状根生长量和目标活性成分积累量为考察指标，筛选得到了高产生物碱的毛状根株系ITHRLⅢ和高产黄酮的毛状根株系ITHRLⅤ，并进行了PCR分子鉴定。 (2)利用BBD实验设计对高产目标活性成分的菘蓝毛状根株系的液体培养条件进行了系统优化，得到了高产生物碱的毛状根株系ITHRLⅢ的最佳培养条件如下:液体培养基类型1/2MS，培养基初始pH值5.8，培养温度24.7℃，蔗糖浓度3.14％，接种量0.75％和培养时间23天;高产生物碱的毛状根株系ITHRLⅤ的最佳培养条件如下:液体培养基类型1/2MS，培养基初始pH值5.8，培养温度24.7℃，蔗糖浓度3.06％，接种量0.75％和培养时间24天。在上述最佳条件下，菘蓝毛状根培养体系Ⅲ中总生物碱的产量为521.77±6.94μg/g DW)，菘蓝毛状根培养体系Ⅴ中总黄酮的产量为438.10±3.46μg/g DW，二者均明显高于2年生大田栽培菘蓝根中的总生物碱(464.69±9.25μg/g DW)和总黄酮(341.73±4.85μg/g DW)的含量。 3、外源植物信号分子对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量和代谢调控研究 (1)利用茉莉酸甲酯(MJ)、乙酰水杨酸(ASA)和水杨酸(SA)信号分子对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的诱导增量和代谢调控进行了研究。实验结果表明SA对生物碱类活性成分的诱导增量效果最佳，而MJ对黄酮类活性成分的诱导增量效果最佳;利用CCD实验设计分别优化得到了SA和MJ对菘蓝毛状根的最佳诱导条件，SA诱导增强23日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅲ生产生物碱的最佳条件为:SA浓度为142.61μM和诱导时间为28.18h，在此条件下总生物碱得率为3146.55±97.63μg/g DW，是未处理空白对照组中总生物碱得率(533.84±13.02μg/g DW)的5.89倍。MJ诱导增强24日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅴ生产黄酮的最佳条件为:MJ浓度为179.54μM和诱导时间为41.87h，在此条件下总黄酮得率为4963.15±110.18μg/g DW，是未处理空白对照组中总黄酮得率(442.63±9.46μg/g DW)的11.21倍。 (2)对现有菘蓝基因资源和已报道的转录组测序数据进行深入挖掘和分析，筛选到了参与生物碱和黄酮类活性成分生物合成路径的11个候选酶基因，并通过qRT-PCR分析这些候选酶基因转录表达水平的差异性变化规律，结合LC-MS/MS分析生物碱和黄酮类活性成分含量的变化规律，初步明确了YUCCA单加氧酶(YUCCA)基因是SA诱导调控菘蓝生物碱生物合成路径中的潜在关键酶基因;查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI)基因和黄烷酮3'-羟化酶(Flavanone3-β-hydroxyalse，F3'H)基因是MJ诱导调控菘蓝黄酮生物合成路径中的两个潜在关键酶基因。 4、紫外辐射对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量和代谢调控研究 (1)利用UV-A、UV-B和UV-C对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的诱导增量和代谢调控进行了研究，实验结果表明UV-B对这两种次生代谢活性成分的诱导增量效果最好;UV-B诱导增强23日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅲ生产生物碱的最佳辐射剂量为162kJ/m2，此条件下总生物碱含量为773.35±28.19μg/g DW，是未处理空白对照组中总生物碱含量(526.09±9.54μg/g DW)的1.47倍;UV-B诱导增强24日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅴ中黄酮积累的最佳辐射剂量为108kJ/m2，此条件下总黄酮得率为7259.12±198.19μg/g DW，是未处理空白对照组中总黄酮得率(439.68±8.27μg/g DW)的16.51倍。 (2)通过qRT-PCR分析菘蓝生物碱和黄酮生物合成路径中11个候选酶基因的转录表达水平，并结合LC-MS/MS分析生物碱和黄酮类活性成分含量的变化规律，初步明确了YUCCA基因是UV-B诱导调控菘蓝毛状根生物碱生物合成路径中潜在的关键酶基因;查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)基因是UV-B诱导调控菘蓝毛状根中黄酮生物合成路径中潜在的关键酶基因。此外，通过测定UV-B诱导前后菘蓝毛状根中抗氧化酶的活力变化以及粗提物的抗氧化活性变化，确定了菘蓝毛状根对UV-B诱导表现出了显著的氧化应激防御响应。 5、固定化食用曲霉对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量和代谢调控研究 (1)利用海藻酸钙固定化的食用黑曲霉孢子(IAN)菌球和米曲霉孢子(IAO)菌球对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的诱导增量和代谢调控进行了研究，实验结果表明IAN对菘蓝毛状根中生物碱和黄酮的诱导增量效果最好;IAN诱导增强23日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅲ生产生物碱的最佳条件为:孢子量约105个/瓶、共培养温度30℃、pH7.0和共培养时间48h，在此条件下总生物碱得率为1378.89±33.47μg/g DW，是未处理空白对照组中总生物碱得率(535.83±15.16μg/g DW)的2.57倍;IAN诱导增强24日龄菘蓝毛状根培养体系Ⅴ生产黄酮的最佳条件为:孢子量约106个/瓶、共培养温度30℃、pH7.0和共培养时间72h，在此条件下总黄酮得率为3018.31±48.66μg/g DW，是未处理空白对照组中总黄酮得率(441.91±7.35μg/g DW)的6.83倍。 (2)IAN诱导能够使内源NO，SA和JA信号分子在菘蓝毛状根中发生顺序瞬时积累;NO在IAN诱导处理的菘蓝毛状根中会迅速产生和积累，在12h时达到峰值(67.35±5.61μmol/g FW)，是未处理空白对照组中NO含量的7.21倍;SA的产生与积累稍微滞后于NO，在24h时达到峰值(202.22±17.98ng/g FW)，是未处理空白对照组中SA含量的8.15倍;JA的产生与积累则稍微滞后于SA，在48h时达到峰值(20.74±1.66ng/g FW)，是未处理空白对照组中JA含量的6.50倍。 (3)通过qRT-PCR分析菘蓝生物碱和黄酮生物合成路径中11个候选酶基因的转录表达水平，并结合LC-MS/MS分析生物碱和黄酮类活性成分含量的变化规律，进一步阐明了YUCCA可能是IAN通过内源SA信号分子介导调控菘蓝生物碱生物合成路径中的关键酶基因，CHI和F3'H可能是IAN通过内源JA信号分子介导调控菘蓝黄酮生物合成路径中的关键酶基因。此外，IAN菌球具有较好的重复使用性，在连续使用5次之后能够保持良好的生物诱导效果。 本研究所建立的稳定高产生物碱和黄酮类次生代谢活性成分的菘蓝毛状根培养体系，一方面为未来利用该离体器官培养体系工业化生产生物碱和黄酮类活性成分奠定理论基础，同时也为研究菘蓝这一非模式植物中生物碱和黄酮类活性成分生物合成调控机制提供一个理想的模式平台。此外，本研究利用诱导子技术既增强了菘蓝毛状根中生物碱和黄酮类活性成分的产量，也初步明确了菘蓝毛状根中调控这些目标活性成分生物合成的一些关键酶基因，为未来利用代谢工程技术手段高效生产菘蓝药用次生代谢活性成分提供了重要的理论依据。同时，本研究为利用诱导子技术调控其他植物组织培养体系高效生产次生代谢活性成分以及阐明其生物合成关键调控酶基因提供了一定的实践经验和参考借鉴。
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