摘要
克氏原螯虾已成为我国重要的淡水养殖虾类之一，近10年来产量以年平均24.56％的速度快速增加。随着人工养殖克氏原螯虾面积的迅速扩大，病害的发生越来越频繁和严重。了解宿主与病原的相互关系，特别是深入了解宿主免疫相关基因对病原的反应机制，对于控制养殖甲壳类病害爆发具有重要意义。 亲环蛋白(Cyclopllilins，简称Cyps)是一种广泛存在于从原核生物到高等哺乳动物中高度保守的重要蛋白，具有多种生物学功能。目前已知最重要的两个生物学功能:一是具有肽基脯氨酸顺反异构酶(cis-trans peptidyl-prolyl isomerse，PPIase)活性能催化蛋白质折叠和转运过程并起着分子伴侣作用;二是具有免疫抑制功能，在体内能介导T细胞进行免疫抑制。CypA是第一个被发现的Cyp家族蛋白。最新研究表明，CypA可能在某些水生生物中具有免疫应激功能。本研究拟以克氏原螯虾为研究对象，从肝胰腺cDNA文库里获得了克氏原螯虾CypA基因cDNA全长，应用生物信息学分析了该基因的结构特征和预测功能，以pET30a(+)为载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌中进行原核表达并制备了特异性的多克隆抗体;应用荧光定量PCR和Westemblot技术分析了该基因在克氏原螯虾各组织间的转录和表达分布特点;用WSSV病毒感染攻毒后，分析了克氏原螯虾各组织中CypA基因的免疫应答情况，为研究克氏原螯虾免疫相关基因在淡水甲壳类中的功能打下基础，为研究无脊椎动物的免疫机制提供一个新的方向。主要研究结果如下: 1、PcCypA序列（GenBank登录号为JX878886）全长为884bp，包括108bp的5'端非翻译区(5'UTR)，281bp的3'端非翻译区(3'UTR)。开放阅读框(ORF)长度为495bp，可编码164个氨基酸残基，理论分子量17.3kDa，具有肽基脯氨酰顺反异构酶家族标签序列（YKGSTFHRVIPNFMCQGG）。PcCypA蛋白整条肽链不存在明显的疏水区，无信号肽，也不存在跨膜区。该蛋白的二级结构组成中，无规卷曲所占比例较大，使蛋白质的构象呈现出多样性的特性。三级结构组成中，8股反向平行的β折叠和2个α螺旋形成一个圆筒状结构，推测形成活性中心区域，证明PcCypA是亲环素家族成员。然而，在结构上克氏原螯虾CypA的Gly70替代真骨鱼类和哺乳动物中的His70，该替换是否让克氏原螯虾失去了趋化作用，在生物进化上是否具有进化意义，有待于进一步研究。系统发育分析表明，PcCypA基因在生物进化过程中符合动物学分类，具有较高的保守性。 2、将PcCypA基因克隆到含有组氨酸标签的原核表达载体pET-30a(+)中，得到重组质粒pET-30a(+)-PcCypA，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞，经IPTG诱导后，SDS-PAGE和Western blot检测分析表达产物，结果显示His-PcCypA能够高效表达，以包涵体形式存在，约23kDa。在水生甲壳类中率先尝试并成功制备了CypA兔源多克隆抗血清，Western blot验证发现抗体可以和原核表达的His-PcCypA融合蛋白杂交出目的条带(23kDa)，也可以与克氏原螯虾肝胰腺全蛋白杂交出目的条带(17kDa)，为后续蛋白表达和免疫组化等相关研究提供物质基础。 3、应用荧光实时定量PCR分析PcCypA基因在克氏鳌虾不同组织中的转录情况。PcCypA在克氏原螯虾的肝胰腺、腮丝、精巢、卵巢、心脏和肌肉等6种组织器官中都有表达，在心脏中表达量最高，其次是肌肉、腮丝、卵巢和精巢，在肝胰腺中表达量最低。CypA蛋白在克氏原螯虾的肝胰腺、腮丝、精巢、心脏和肌肉中均有发现，大小约17kDa，与根据CypA氨基酸序列预测出的蛋白大小基本一致。然而在卵巢中未发现相应的蛋白条带，却出现了极其复杂的表达模式，有可能是与其他物质形成了蛋白质复合体。 4、WSSV病毒对克氏原螯虾有很强的感染能力。病理组织学观察发现感染WSSV的克氏原螯虾心脏和肌肉组织中都出现了肌纤维断裂溶解的现象，在肝胰腺组织中出现了脂肪颗粒脱落、细胞空泡化和细胞膜溶解现象。WSSV感染后不同组织PcCypA基因对感染后的响应有时序差异。以24hpi为界，0-24hpi为注射应激期，在此期间，肝胰腺(0-12hpi)、心脏(12-24hpi)等组织的PcCypA转录表达均有上调。24-36hpi为应激恢复期，绝大多数的组织中PcCypA转录表达均出现了回落，但在心脏、肌肉、血淋巴组织中出现了上调，说明这三个组织对WSSV感染的响应早于其他组织。48hpi之后为WSSV感染响应阶段，在此期间鳃和肌肉组织有大量PcCypA转录表达，肝胰腺和精巢组织表达下调。96-120hpi为感染响应后期阶段，肝胰腺和肠组织的PcCypA转录水平再次上调。推断CypA在克氏原螯虾中可能参与机体的先天免疫系统，参与生物性免疫响应和物理性应激响应。 5、根据RT-PCR扩增出来的PcCypA基因ORF序列在3个地理群体60个个体中发现了2个变异位点，3'UTR区域发现1个变异位点，共发现8个单倍型，单核苷酸多态性较高。因此推断，虽然PcCypA是一个高度保守的基因，在但ORF和3'UTR区域都存在丰富的碱基变异，适合做SNP分析。
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