有机酸类根系分泌物影响烟草青枯病发生的机制研究

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中文摘要：在土壤生态环境中，植物通过释放根系分泌物与土壤微生物进行信息交流、物质交换，并形成了寄生、共生、侵染、拮抗等互作关系，形成了一个由根系分泌物介导的特殊的根际微生态环境，显著影响着植物的健康。此外，在与病原微生物互作中，根系分泌物能够作为化学信号物质调控土壤病原微生物的活性，还可以通过改变根际土壤微生态环境诱导土传病害的发生。因此，明确根系分泌物与病原微生物，以及由根系分泌物介导的植物-病原微生物-微生态之间的关系对理解土传病害的发生与调控技术的研发具有重要意义。烟草青枯病是由茄科青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种重要的土传细菌性病害，基本覆盖了我国主要的烟叶产区，是引起烟草连作障碍的重要因子之一。而目前对于青枯病的发生，基于三角病害理论，大部分研究从青枯菌、烟草与环境因素考虑，却忽视了植物自身生物特性在病害发生中的作用。因此探究根系分泌物在病害三角关系中的作用，有利于进一步深入理解青枯病发生原因，对形成新防控理念思路、研发绿色调控技术尤为关键。有机酸是根系分泌物的主要成分之一，在根际土壤生态环境中具有重要的生态功能，如可以作为信号调控物质，生长活性因子或营养源供给微生物的生长。但部分有机酸的长期释放一方面直接刺激土壤病原微生物的繁殖，导致植株与土壤免疫力下降，另一方面扰乱微生物群体结构平衡，进而引起土传病害发生。目前已经有较多的研究报道了有机酸与个体病原微生物以及病害发生之间关系，但有机酸类烟草根系分泌物是否与茄科青枯雷尔氏菌存在一定的关系，是否能够导致青枯病的发生，以及相关机制研究涉及较少。据此，本学位研究论文以有机酸类烟草根系分泌物与茄科青枯雷尔氏菌为研究对象，首先采用GC-MS对烟草根系分泌物中有机酸的种类进行检测分析，选用具有化感活性的有机酸物质月桂酸、邻苯二甲酸、肉桂酸、延胡索酸、肉豆蔻酸、苯甲酸，从青枯雷尔氏菌个体角度，探究了有机酸对青枯雷尔氏菌生长特性、生物膜形成的影响；在此基础上进一步评价有机酸对青枯雷尔氏菌运动、趋化特性的诱导作用，以及对烟草发病特性的影响。此外，从土壤微生物群体角度，立足于根系分泌物-土壤微生物-病原微生物三者关系，分别评估了烟草根系分泌物、有机酸等对土壤微生物群落结构特征以及烟草青枯病发生的影响，阐释了烟草根系分泌物有机酸的释放对土壤免疫以及青枯病发生的机制。本学位论文的主要研究结果如下： 1烟草根系分泌物中有机酸（TRE-OA）的鉴定与分析采用砂培技术，对烟草品种云烟87移栽后约40d的烟苗根系分泌物进行收集。采用GC-MS检测分析表明，烟草根系分泌物酸性、中性、碱性三个组分中的有机酸物质共有26种，其中酸性组分中的检出率最高达到21种，主要包括延胡索酸、丁二酸、3-羟基丁酸、正己酸、正戊酸、苯甲酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十五烷酸、2-戊醇乙酸、2-丙烯酸、正十六酸、3-羟基-4-苯甲酸、硬脂酸、芥酸、月桂酸、邻苯二甲酸。此外，根系分泌物中检出成分还包括酯类与烷烃类物质，其中酯类物质7种，主要包括苯甲酸乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、己二酸二辛脂、乙酸丁酯、2-丙烯酸丁酯、乙酸戊酯、邻苯二甲酸二丁酯、丁酸乙酯、邻苯二甲酸二乙酯；烷烃类物质30种，主要包括壬烷、环己烷、环戊烷、(E)-3-十二烯、2,6,10-三甲基十二烷、1-十五碳烯、(Z)-4-十四烯、1-十九烯等。 2 TRE-OA对青枯雷尔氏菌生长与生物膜形成的影响测定了有机酸处理对青枯雷尔氏菌生长的影响，结果表明，在营养培养基NB与基本培养基M63测定条件下，6种有机酸月桂酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、邻苯二甲酸、苯甲酸、延胡索酸在50-200μM浓度范围内对青枯菌12 h与24 h内的生长均没有显著刺激或抑制作用。进一步通过高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）与高效气相色谱（High Resolution Gas Chromatography, HPGC）检测基本与营养培养条件下青枯菌对肉桂酸与肉豆蔻酸利用情况，培养12 h、24 h与36 h后，两种有机酸的残留量分别达到87%-95%与85%-90%，表明这些有机酸物质不能够作为碳源营养物质被青枯雷尔氏菌利用。采用96孔结晶紫染色法与荧光定量PCR技术测定了有机酸处理对青枯雷尔氏菌生物膜形成以及相关基因表达的影响。结果表明接菌培养24h后，肉桂酸、肉豆蔻酸、苯甲酸、延胡索酸一定浓度下均能够刺激青枯雷尔氏菌生物膜的形成。其中50-200μM的苯甲酸与肉豆蔻酸的提高率分别达到60%-116.70%与55.30%-61.40%，并与对照存在显著性差异；其次100-150μM浓度的肉桂酸、延胡索酸也能够显著诱导青枯雷尔氏菌生物膜的形成。RT-PCR结果显示，50-150μM的苯甲酸均能够提高青枯雷尔氏菌生物膜形成相关基因epsE、lecM的表达量，与对照相比提高了1.75、5.38、4.88倍与4.25、1.48、1.97倍。此外，200μM延胡索酸与100μM肉豆蔻酸处理也显著诱导了epsE的表达，相比对照表达量增加了4.13倍与5.25倍。综上可知肉桂酸、肉豆蔻酸、苯甲酸、延胡索酸能够作为青枯雷尔氏菌生物膜形成的诱导物质，并能够显著刺激相关调控基因epsE、lecM的表达。 3 TRE-OA对青枯雷尔氏菌与烟草互作特性的影响 3.1 TRE-OA对青枯雷尔氏菌侵染烟草特性的影响采用平板泳动法以及毛细管法测定了青枯雷尔氏菌在有机酸作用下的运动与趋化活性，结果表明，6种有机酸在50-200μM浓度范围内均能一定程度诱导青枯雷尔氏菌的运动活性。其中50-200μM肉豆蔻酸刺激效果最强，与对照相比平板运动直径分别提高了4.22倍，4.25倍，4.37倍与3.89倍，其次肉桂酸与延胡索酸也能够显著提高青枯雷尔氏菌的运动活性。对青枯雷尔氏菌趋化平板定性分析，6种有机酸均能够表现出一定的趋化诱导活性，其中在150μM浓度下的效果最佳。进一步的毛细管定量检测表明，肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸在150μM的浓度下能够显著诱导青枯雷尔氏菌进入毛细管，其数量分别达到7.07×107 CFU/mL、6.77×107 CFU/mL与5.70×107 CFU/mL，显著高于对照3.02×107 CFU/mL。此外，肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸同样能够显著提高趋化相关基因cheA、cheW、cheY，运动相关基因motA、motB、filA的表达量，这一结果与趋化性毛细管定量检测结果基本一致。进一步的根部定殖试验表明，肉豆蔻酸、肉桂酸能够显著诱集青枯雷尔氏菌在根部的定殖粘附，定殖量分别是对照的18.67倍与15.08倍。综合以上试验结果表明，肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸能够作为化学引诱剂，诱导青枯雷尔氏菌的运动、趋化活性，并强烈的诱集青枯菌在烟草根部的定殖。 3.2 TRE-OA对烟草青枯病发病特性的影响为了明确有机酸物质对烟草青枯病发病特性的影响，分别设计了室内盆栽与大田试验。室内盆栽结果表明，外源添加有机酸能够提高青枯病菌的侵染活性，其中接菌后14d，经过肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸处理后的烟株成活率迅速下降，分别为10%、20%、20%，显著低于对照50%；接菌18d后肉豆蔻酸、肉桂酸处理烟株的成活率将至10%，而对照为50%。此外肉豆蔻酸、肉桂酸、延胡索酸三个处理的病程进展曲线面积分别高出对照476.25、420.41、391.25（基于病情指数，DI）与583.34、488.23、486.65（基于发病率，DS），并存在显著性差异。进一步田间试验表明，肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸均能够影响烟草青枯病的发生，表现为促进作用，肉桂酸效果最为显著。其中肉桂酸处理后发病初期烟草根际带菌量达到1.07×104 CFU/g，是对照的2倍左右；处理13d后烟株发病率与病情指数分别达到21.19%、3.01，显著高于对照的10.55%、1.32，并与其他处理存在显著性差异（P<0.05），处理19d后发病率与病情指数均达到29.42%与6.40，显著高于对照的17.68%与3.67。因此，通过室内盆栽与大田试验表明，肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸能够促进青枯菌在根部的定殖与前期侵染，提高青枯病的发病程度，其中以肉桂酸的刺激效果最明显。 4土壤微生物对TRE-OA的降解作用通过外源添加的方式测定了肉桂酸、肉豆蔻酸在土壤环境中的含量动态变化。结果表明，在正常土壤中培养14天，75μg/g与150μg/g肉桂酸与肉豆蔻酸的降解率分别达到94%、95%与84%、93%以上，而灭菌土壤中肉桂酸与肉豆蔻酸的残留率达到80%与60%以上，表明土壤中部分微生物具有降解有机酸的功能。此外，进一步明确了土壤真菌哈茨木霉T-22对肉桂酸的降解作用，在PDB培养基中，共培养72 h后哈茨木霉能够有效降解50-150μM肉桂酸，其降解率达到100%。且通过对肉桂酸的降解，哈茨木霉能够显著的降低青枯病发生程度，接菌16d后烟草青枯病的发病率与病情指数平均降低了27.22%与25.52。 5烟草根系分泌物对土壤微生物群落结构的影响采用16S rDNA高通量测序技术测定了烟草根系分泌物处理对土壤微生物群落结构的影响。结果表明，烟草根系分泌物持续添加，能够显著影响土壤细菌、真菌、放线菌的种群数量，并改变土壤细菌的群落结构，其中降低了放线菌门（Actinobacteria）数量，增加了酸杆菌门（Acidobacteria）菌群的比例。在不同分类水平上进行差异比较分析，随着根系分泌物添加次数的增加与培养时间的增加，鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）相对丰度逐渐降低，酸杆菌科（Acidobacteriaceae）呈现逐渐增加的趋势；而芽单胞菌属（Gemmatimonas）的比例在处理7d后达到最高，而之后显著降低。进一步对细菌群落进行LEfSe分析，随着根系分泌物添加次数与培养时间的增加，土壤微生物中优势微生物种群呈现先上升后下降的趋势，其中优势类群数量7d（13种）>14d（6种）>3d（5种）28d（4种）>0d（3种）。此外进一步的基于Biolog-ECO方法，对土壤微生物的功能多样性进行分析，表明根系分泌物处理7d后土壤的微生物对碳源的利用能力最强，尤其是对胺类与聚合类化合物。 6肉桂酸影响烟草青枯病发生的微生态机制分析通过外源添加的方式进一步评价了肉桂酸的施用对土壤免疫青枯病以及根际微生物结构的影响，结果表明，75μg/g与150μg/g肉桂酸处理后显著降低烟草根际微生物真菌群落的多样性与丰富度，优势菌属从13种降低为6种，镰刀菌属的比例显著增加至79.93%与69.96%，并且提高了丛赤壳科（Nectriaceae）、假散囊菌科（Pseudeurotiaceae）、肉座菌科（Hypocreaceae）、座囊菌科（Dothideomycetes）相对丰度，刺激曲霉属（Aspergillus）、茎点霉属（Phoma）、镰刀菌属（Fusarium）的大量增长；在根际细菌群落变化方面，肉桂酸处理显著提高了变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）雷尔氏菌属（Ralstonia）相对丰度，降低了放线菌门（Actinobacteria）与奇古菌门（Thaumarchaeota）相对丰度。此外，肉桂酸处理显著降低了根际微生物功能多样性，以及对碳水化合物、酚酸、羧酸、胺类等碳源的利用能力。进一步对肉桂酸处理后的土壤进行盆栽试验，发现土壤免疫活性降低，烟草青枯病的发生程度要显著高于对照组。因此，肉桂酸处理后能够扰乱土壤微生物结构平衡，提高病原微生物种群丰度，降低有益菌种群比例，进而加剧青枯病发生。综上所述，本学术论文从青枯雷尔氏菌与烟草互作的角度，首先分析了有机酸对青枯雷尔氏菌与烟草互作特性的影响，明确了肉桂酸、肉豆蔻酸、延胡索酸能够作为化学引诱剂诱集青枯雷尔氏菌在根部定殖，并刺激生物膜形成，造成早期侵染；从土壤微生物与有机酸互作角度分析，明确了烟草根系分泌物与有机酸物质能够显著改变微生物结构与功能特征，引起有益与病原微生物种群比例失调，并降低了微生物对胺类、碳水化合物等碳源的整体利用能力，导致青枯病发生；同时明确了土壤微生物对根系分泌物有机酸的响应特性，通过降解作用减少有机酸在土壤中大量累积；找到了影响青枯病发生的两个重要因子肉桂酸与哈茨木霉，其中肉桂酸通过诱集青枯菌在根部定殖，改变土壤微生物结构特征，降低土壤有益菌群丰度，加剧青枯病发生，哈茨木霉通过降解土壤有机酸，维持有机酸释放与微生物群落稳定之间的动态平衡，降低青枯病的发生。该研究结果对于从根系分泌物有机酸角度理解青枯病的发生机制具有重要意义与理论价值，为青枯病的绿色生态防控技术的研发提供了新思路，为微生态理念调控青枯病与维护植物健康提供了重要的理论支撑。

作者：

李石力

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关键词：

烟草根系分泌物烟草青枯病青枯雷尔氏菌有机酸土壤微生物

授予学位：

博士

学科专业：

农药学

导师：

丁伟

学位年度：

2017

学位授予单位：

西南大学

语种：

中文

中图分类号：