摘要
目的: 在小鼠神经母细胞瘤细胞N2a(N2a/WT)及稳定表达人源APP695的N2a(N2a/APP695)细胞的AD细胞模型中，研究开心散和开心散加味新及开心散加味新方中几种不同单体对N2a/APP695细胞中淀粉样前体蛋白(APP)的影响;选取目标单体，研究其对N2a/APP695细胞中APP、相关分泌酶(ADAM10、BACE1、PSEN1)、酶解产物(β-CTF、Aβ)的影响及相关分子机制;在N2a/APP695细胞及LPS诱导的N2a/WT和BV2细胞炎症模型中，观察其对炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平影响。 方法: 用含有一系列浓度开心散和开心散加味新方水提液以及丹参素、隐丹参酮、丹酚酸A、川芎嗪和盐酸川芎嗪溶液的培养基分别培养N2a/APP695细胞24h后，采用Western blot检测细胞中APP含量变化，筛选目标单体（丹参素）。用含有不同浓度丹参素溶液的培养基培养分别N2a/APP695细胞24h后，CCK-8法检测细胞活性;Western blot检测细胞中APP、ADAM10、BACE1、PSEN1、β-CTF、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K含量变化;RT-PCR检测细胞中APP、ADAM10、BACE1、PSEN1、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平;激光共聚焦检测细胞中APP、BACE1、Aβ表达及共定位变化;用Akt抑制剂GSK-690693预处理N2a/APP695细胞1h后，加入丹参素溶液培养24h，Western blot检测细胞中BACE1、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K含量变化。（以上实验均由正常条件下培养的N2a/WT细胞作为对照）。用含有不同浓度丹参素溶液的培养基分别预处理N2a/WT和BV2细胞24h后，用不同浓度LPS分别诱导N2a/WT和BV2细胞24h，CCK-8法检测细胞活性;RT-PCR检测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平。 结果: 与N2a/WT细胞相比，N2a/APP695细胞中APP蛋白含量明显增加;处理24h后，开心散加味新方水提液以及丹参素、隐丹参酮和盐酸川芎嗪溶液均能不同程度降低N2a/APP695细胞中APP蛋白含量。除APP外，N2a/APP695细胞中BACE1、β-CTF、Aβ蛋白含量及APP、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平明显高于N2a/WT细胞;选取丹参素作为研究对象发现，丹参素作用24h能够显著降低N2a/APP695细胞中APP、BACE1、β-CTF、Aβ蛋白含量及APP、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平;共聚焦结果表明细胞内APP与BACE1共定位减少。同时，与N2a/WT细胞相比，N2a/APP695细胞中p-PI3K、p-Akt含量降低;丹参素作用24h显著增加N2a/APP695细胞中p-PI3K、p-Akt含量;加入Akt抑制剂后，细胞内p-Akt含量降低，BACE1含量相应增加。LPS能够显著增加N2a/WT和BV2细胞中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平;丹参素预处理24h能够降低由LPS诱导的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平，同时增加N2a/WT和BV2细胞活性。 结论: 开心散加味新方水提液能够降低N2a/APP695细胞中APP和BACE1含量，其效果优于开心散原方。开心散加味新方重要活性成分丹参素能够减少N2a/APP695细胞中APP含量，同时通过激活PI3K/Akt通路，减少BACE1产生，抑制APP淀粉样蛋白加工途径，降低Aβ形成;丹参素还能降低N2a/APP695细胞及LPS诱导N2a/WT和BV2细胞炎症反应，具有抗炎作用。
NETL