摘要
锌（Zn）是动植物体内非常重要的一种微量元素，Zn营养平衡失调会影响动植物的生长和健康。本实验室前人发现在相对高的Zn2+培养条件下，At3g08650的T-DNA插入拟南芥突变体幼苗生长受到抑制，叶片叶脉周围细胞早衰，即出现高锌敏感表型，表明At3g08650可能参与调控植物叶细胞Zn2+营养平衡，因此将该基因命名为ZNE1（ZINC NUTRITION ESSENTIAL1）。 本论文对ZNE1是否参与Zn2+转运以及ZNE1功能位点的鉴定展开研究。首先将ZNE1克隆入酵母表达载体pFL61，并将其转化进Zn吸收缺失型酵母突变体zrt1zrt2（ZHY3）中进行酵母异源功能互补实验，结果显示，ZNE1基因使酵母突变株ZHY3恢复Zn2+吸收功能，即证实ZNE1具有Zn2+转运功能。随后为了鉴定ZNE1基因的功能位点，通过KinasePhos网站预测了ZNE1的10个磷酸化位点，并对其进行了单碱基（S39A，W105R，G115R，S133A，G144D，S185A，G189V，V192L，S560I，T584A），双碱基（S185A，G189V）以及三碱基（S185A，G189V，V192L）突变。将含有点突变的ZNE1基因克隆入pFL61质粒并转化进ZHY3中，实验结果显示，转化后的酵母突变株均不能使ZHY3恢复Zn2+吸收功能，说明这10个磷酸化位点是Zn2+转运相关的功能位点。最后通过等温滴定微量热法确定ZNE1的Zn2+结合位点，通过TMHMM网站对ZNE1进行分析，发现其具有14个跨膜区域，膜外有8个短肽（被命名为outside1-8），膜内有7个短肽（被命名为inside1-7）。用超灵敏等温滴定微量热仪MicroCal iTC200测定ZnSO4滴定不同短肽的热力学数据，根据滴定曲线确定Zn2+结合短肽，结果显示inside2和outside1是与Zn2+发生结合反应的重要短肽。通过MicroCal iTC200以及酵母异源功能互补实验，进一步确定126位的赖氨酸和131位的组氨酸是ZNE1的Zn2+结合位点。ZNE1功能的研究有助于揭示植物Zn稳态调控的分子机制，为后续培育合理的Zn营养作物奠定基础。
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