高产番茄红素酿酒酵母的设计构建与发酵过程优化

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中文摘要：异源代谢路径和底盘细胞的适配性是异源微生物合成的关键因素。本研究以构建高产番茄红素的酿酒酵母为目标，对底盘细胞和异源路径进行理性设计和交互优化，极大地提高番茄红素产量和纯度。与此同时，针对改造过程中发现的关键遗传靶点YPL062W对萜类物质生产的影响进行了系统表征，重新注释了它的生物学功能。首先，以酿酒酵母CEN.PK2为宿主细胞构建诱导型番茄红素异源合成路径。通过两种增强型GAL诱导策略（Δgal1Δgal7Δgal10、Δgal80）比较，发现前者更有利于番茄红素合成。在此基础上，敲除ypl062w使得番茄红素产量提高1.5倍，同时乙酸积累大量减少，甲羟戊酸（MVA）途径关键前体乙酰辅酶A的含量增加约1倍，因此敲除ypl062w的酿酒酵母作为后续研究的底盘细胞。此外，我们发现敲除ypl062w能够有效提升酿酒酵母合成单萜、倍半萜、二萜、三萜及四萜的产量，具有普遍性。通过转录组分析发现敲除ypl062w主要从上调乙酰辅酶 A合成、MVA路径、异源基因表达、能量合成、细胞膜关键组分合成这五个方面强化异源萜类合成。而且，YPL062W并不发生转录，而是属于ALD6的核心启动子，且 ALD6表达量与萜类化合物产量呈负相关关系。因此， YPL062W主要通过调控ALD6转录作用于萜类合成。在强化前体物质供给的底盘细胞基础上，进一步优化番茄红素合成路径，即通过5种CrtE、2种CrtB和3种CrtI的来源组合筛选强化异源路径通量，获得产量最优的路径基因组合；并利用启动子强度和整合拷贝数微调途径限速酶Blakeslea trispora CrtI，提高番茄红素占总类胡萝卜素的比重。最后，再优化底盘细胞，即通过考察不同交配型的酵母底盘细胞以及远端遗传基因座对番茄红素合成的影响，进一步优化产量；通过上调胁迫响应因子 INO2增强酵母对番茄红素的耐受能力；通过引入异源血红蛋白基因VHb提高细胞和产物得率。经过上述适配优化，番茄红素产量提高近30倍（从2.43 mg/g DCW到66.14 mg/g DCW），且其占总类胡萝卜素的比例达到91.41%。最终经发酵过程（培养基、补料方式、溶氧控制）优化，在50 L发酵罐补料分批试验中，番茄红素产量达到2.75 g/L，是目前酿酒酵母中的最高产量。

作者：

陈艳

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关键词：

番茄红素酿酒酵母底盘细胞改造异源路径优化适配性

授予学位：

博士

学科专业：

生物化工

导师：

元英进

学位年度：

2017

学位授予单位：

天津大学

语种：

中文

中图分类号：