摘要
果胶甲酯酶(Pectin methylesterases，PME)是对植物细胞壁的重要组成成分—果胶发生催化作用的第一个关键酶，它的催化作用能够使果胶产生不同结构和功能，在植物生理过程和逆境胁迫响应中具有重要意义。PME属于多基因家族编码的蛋白质，存在多种亚型，不同亚型间结构的变化可能与其细胞定位和功能有关。而果胶甲酯酶抑制剂(Pectin methylesterase inhibitors，PMEIs)能够抑制果胶甲酯酶的脱酯化作用，从而调控PME的活性。目前，在模式植物拟南芥中对PME和PMEI基因家族的结构、进化、相互作用机理以及抵御逆境等方面有了一定研究，然而，在木本植物中还未见这两个家族基因的系统报道。基于它们在植物细胞壁形成和胁迫响应中的重要功能，本研究以模式树种—杨树（Populus）为实验材料，利用生物信息学技术从基因组水平研究PME和PMEI基因家族特征，并对其基因家族组织特异性表达模式进行分析;同时，利用转录组技术筛选了盐胁迫下差异表达的PME和PMEI基因家族成员，并通过real-time RT-PCR对差异表达基因进行验证;最后对盐胁迫果胶甲酯酶相关生理指标（果胶酶与果胶甲酯酶活性、果胶含量）进行分析。主要研究结果如下: (1)利用南芥PME和PMEI基因家族蛋白隐马氏模型(HMM，Hidden Markov Model)检索毛果杨蛋白库共得到80个PME基因家族成员（其中type1-P ME基因52个、type2-PME基因28个）和54个PMEI基因家族成员。然后，通过理化性质、亚细胞定位、信号肽预测、染色体定位、同源性以及蛋白序列结构等分析，对PME和PMEI基因家族特征进行研究。结果表明，这两个基因家族编码的蛋白质多为分泌蛋白，其蛋白序列N端具有15-35个氨基酸左右的信号肽，其理论等电点多分布在碱性、中性范围。结构分析显示PME氨基酸序列不仅有39个保守氨基酸残基，还有5个保守的氨基酸区段，分别为GxYxE、QAVAL、QDTL、DFIFG、LGRPWK。而PMEI氨基酸序列的相似程度并不高，仅发现4个高度保守的半胱氨酸残基。另外，分析还发现pro-region的氨基酸序列与PMEI存在一定程度的相似性。 (2)通过mRNA表达数据库分析毛果杨PME和PMEI基因家族在不同组织中（幼叶、根尖、根、茎）的表达模式，研究发现该家族基因在不同组织中表达情况不同:在根、幼叶、根尖、茎中表达的PME基因数分别为28个、30个、36个、32个，PMEI基因数分别为20个、19个、21个、23个（FPKM＞1）。这些表达的基因对该组织的生理过程调控可能具有重要作用。 (3)利用RNA-seq技术对短期盐胁迫条件下(0h、6h、12h和24h)毛白杨幼苗进行转录组水平差异基因表达分析后，筛选出盐胁迫诱导差异表达的PME基因22个、PMEI基因2个。进一步通过real-time RT-PCR对随机挑选的4个基因进行定量表达模式验证，结果与相应的RNA-seq分析的趋势基本相同。同时，生理分析显示短期盐胁迫条件下果胶酶活性明显降低、果胶甲酯酶活性明显提高，但果胶含量呈现先增加后降低的趋势。这说明盐胁迫对部分PME和PMEI基因的表达产生了明显影响，并且相应的果胶甲酯酶活性也发生了变化。这为后续研究PME和PMEI基因家族成员在杨树盐胁迫响应过程中如何调控细胞壁代谢奠定基础。
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