摘要
结核病(TB)是由结核分枝杆菌引起的严重感染性疾病，是全球十大死因之一。据WHO的报告，2016年全球有1，040万人患有结核病。其中，儿童感染者为100万。170万人死于该病（其中40万人患有艾滋病毒）。抗生素在结核病治疗中的长期使用，引起耐药结核菌感染病例增多。2016年，世界范围内估计新增60万例多重耐药结核菌感染病例，为结核病的防治工作带来前所未有的严峻挑战。因此，发现新的药物靶点和设计新型抗结核药物迫在眉睫。 氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases，aaRS）作为细胞内高度保守蛋白酶家族，参与到生物遗传信息翻译过程中，负责将氨基酸转移到对应的tRNA上，是确保细胞内遗传信息忠实翻译的酶。根据结构与模序(motif)的差异，aaRS被分为两类，每一类由10种酶组成。在所有的20种氨酰tRNA合成酶中，MetRS的生物学作用最为重要。它不仅识别初始tRNA，同时参与蛋白质肽链的延伸。除此之外，不同物种来源的MetRS具有结构上的多样性。在近几年的aaRS抑制剂研究中，发现了一些氨酰tRNA合成酶抑制剂，具有高选择性和强抑制能力。aaRS已被证明是理想的抗生素作用靶点。 结核分枝杆菌MetRS(Mycobacterium tuberculosis Methionyl-tRNA synthetase，MtMetRS)的研究从上个世纪末报道其氨酰化反应后就没有新的进展。这与其重组蛋白制备困难有关。由于MetRS抑制剂存在专一性强，抗菌谱覆盖面窄的问题。用于结核病治疗的MetRS抑制剂需要依据MtMetRS结构进行设计和筛选。获得准确的MtMetRS分子模型是基于结构理性设计抑制剂的基础。但从目前已经解析的结构来看，已解析的8种MetRSⅠ类酶中只获得了1个无配体结构，而已解析的4种MetRSⅡ类酶中有3种获得了无配体结构。统计数据及以往的文献显示，无配体的MetRSⅠ类酶难于获得衍射质量的晶体。MtMetRS属于MetRSⅠ类酶。因此针对结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶的结构学研究要解决重组蛋白质制备和蛋白质结晶问题。 我们通过尝试构建不同重组质粒进行重组蛋白表达筛选，最终解决了MtMetRS重组蛋白制备问题。通过生化实验首次阐明了MtMetRS的酶促动力学反应。通过大规模的晶体筛选、结晶条件优化，成功获得无配体MtMetRS晶体，并解析了MtMetRS的无配体晶体结构和结合中间产物Met-AMP的复合物晶体结构（MtMetRS：Met-AMP）。结构分析显示MtMetRS：Met-AMP晶体结构与其他已解析MetRS有着相似的Cα骨架结构。无配体MtMetRS晶体结构显示其催化结构域采用了与复合物结构不同的构象。已解析的无配体结构及其复合物结构的催化结构域具有相似构象，在两种状态下催化结构域均为闭合状态，形成完整的疏水区，底物结合口袋始终保持在结合、催化状态。而无配体MtMetRS的催化结构域呈现开放状态，没有形成封闭的疏水区，由疏水性氨基酸构成的核酸结合环(Nucleotide binding loop，NBL)暴露于水溶剂中，处于塌陷状态。这使得MtMetRS的甲硫氨酸结合口袋完全封闭，而单磷酸腺苷结合口袋缩小。无配体MtMetRS与复合物MtMetRS：Met-AMP的结构比较显示，底物结合到MtMetRS后，诱导其催化结构域发生构象变化，主要包含三个部位：一、核酸结合环由催化核心区的疏水口袋底部向口部移动;二、诱导CP(connective peptide)结构域下压，稳定α2结构;三、Rossmann fold的β折叠结构发生结构重排。这些构象变化使MtMetRS的催化结构域形成一个疏水区域。对比不同物种MetRS结合底物的前后变化，发现已解析的MetRS采用Lock-and-Key模型催化底物，而结核分枝杆菌MetRS采用Induced Fit模型催化底物。生化实验结果显示相同反应条件下MtMetRS对底物的亲和性和催化效率均低于大肠埃希氏菌MetRS。突变实验显示构成催化核心疏水区的α2结构稳定性对MtMetRS酶活性影响巨大。推测α2的稳定性影响疏水催化核心的完整性，从而影响酶催化能力。而α2的稳定性与CP结构域的构象变化相关，这可能是MtMetRS采用Induced Fit模型结合底物及低催化效率的原因。 通过分析MetRS分子表面保守氨基酸的分布区域，我们发现MetRS的高度保守区集中在底物结合区和tRNA反义密码子结合区。而组成tRNA氨基酸接受臂结合区的氨基酸残基显示出较低的保守性。人细胞质MetRS(HcMetRS)与MtMetRS的tRNA氨基酸接受臂结合区的比较显示，HcMetRS是一个结合面，而MtMetRS分子是一个疏水口袋。这为设计特异性抑制剂提供了结构生物学证据。此外我们还发现在无配体MtMetRS的核酸结合环和α10之间及β2和β3之间存在的特异性疏水口袋与MtMetRS的构象变化相关，这两个疏水口袋的占据可以抑制底物诱导的MtMetRS构象变化，也是很好的抑制剂设计靶点。 综合各种试验及结构分析结果，我们提出MtMetRS不同于已知MetRS的催化机制模型：MtMetRS在催化反应中采用Induced Fit模型结合底物，而不是其他物种MetRS采用的Lock-and-Key模型。通过与人细胞质MetRS进行比较，我们指出了MtMetRS特有的与酶催化活性相关的疏水结合口袋，为基于结构的理性设计抑制剂提供了精确模型和科学依据。
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