摘要
呼吸道感染给人类造成了严重的疾病负担，特别是对于儿童的生命健康构成了极大的威胁。能够导致人类呼吸道感染的病原体种类繁多，超过80％的病例由病毒感染引起，而重症及死亡病例则主要归因于细菌的感染。准确掌握呼吸道感染的病原谱，可以为制订相关传染病的防控策略提供依据;临床上及早明确病原体，进行针对性的抗感染治疗则是控制感染的关键环节。目前常规使用的病原体鉴定方法:如病原体培养、血清学检测、免疫学检测等存在着耗费时间长、灵敏度低等缺点。以PCR技术为代表的分子检测方法灵敏快速，但大多无法兼顾病原体覆盖广度和样本检测通量这两个关键因素。同时，一些较为先进的检测技术却因昂贵的检测费用而难以广泛应用。鉴于此，本课题的目标是建立一种高效、廉价的呼吸道病原体检测方法。 在本课题中，我们使用MassARRAY系统作为检测平台，利用多重PCR与MALDI-TOF质谱技术联用来鉴定目标病原体。通过对呼吸道病原体流行病学、检测方法的指南和文献进行综述，我们选择在呼吸道感染中常见、并且与疾病发生相关的病原体纳入检测范围。对于每一种目标病原体，选择种间特异且种内保守的基因作为检测靶基因。根据不同的病原体类别，其序列的收集使用到了本研究中优化的四种不同策略，对收集到的序列多重比对的同时进行聚类分析，根据结果选择靶基因中最为保守的区域作为设计靶点。最终设计完成了常见呼吸道病毒(RV-MS)和呼吸道细菌(RB-MS)两套检测试剂。RV-MS是一个24重的检测方法，可同时鉴定21种常见的呼吸道病毒。RB-MS是一个12重的检测方法，可同时鉴定11种引起人类肺炎、脑膜炎或者百日咳的重要细菌性病原体。 我们使用阳性的临床样本及分离纯培养的菌株来评价新方法的特异度，评价结果说明，RV-MS和RB-MS能够准确鉴定目标病原体，且不会与其他非目标病原体发生交叉反应。对于灵敏度的评价，我们使用新方法检测10倍稀释的质粒梯度。结果表明，对于每一种目标病原体，两种方法的检出限大约在10拷贝每反应至100拷贝每反应之间。这样的高灵敏度能够实现混合感染样本中低丰度病原体的鉴定。 为了评价RV-MS的实际应用能力，我们应用该方法对336份取自呼吸道病毒急性感染患者的鼻咽拭子样本进行了筛查，筛查结果同PCR或反转录PCR检测结果进行比较。去除掉4份RNase-P阴性的样本，RV-MS在307(92.5％)份样本中检测得到了阳性结果，PCR相关方法在297(89.5％)份样本中得到了阳性结果，在这其中，有306(92.2％)份样本检测结果一致，其中包括了25(7.5％)份检测为阴性的样本和281(84.6％)份检测为阳性的样本。 为了评价RB-MS的临床应用能力，我们应用该方法对204份鼻咽拭子样本进行检测，这些样本取自因肺炎而住院的儿童。在这其中，有167(81.9％)份样本检测阳性，其中包括了93(55.7％)份多重感染样本。我们使用荧光定量PCR和巢式PCR对阳性的结果进行验证，一致率为81.4％。对于未能验证的阳性结果，我们使用灵敏度更高的3D数字PCR对其再次验证，结果表示差异的原因是由于新方法相对于PCR相关方法有更高的灵敏度。 RV-MS和RB-MS具有高效的检测能力以及良好的应用价值。首先，新的方法可以在两孔反应内同时鉴定32种病原体，其检测重数要比多重荧光定量PCR多4-5倍，可以显著节约样本的用量。其次，新的方法可以使用384孔板来提升检测通量，380份样本的病毒、细菌同时筛查可在一个工作日之内，由一名技术人员完成。第三，两种方法可根据实际情况选用，且方法内检测目标可灵活增减。第四，如果不计算核酸提取的费用，每个样本完成32种病原体检测的成本约为50元人民币，单个病原体检测成本低于2元人民币，在目前的检测技术中具有较强的竞争力。第五，新的方法基于MALDI-TOF质谱平台研发，并不局限于MassARRAY平台，因此实际工作中可选择适当的质谱平台，从而拓展了应用范围。 综上所述，本课题所建立的检测方法在呼吸道感染性疾病早期的病原体筛查、或者大规模流行病学研究中，都是强有力的研究工具。同时也为症候群相关病原体筛查技术研发提供了范例。
NETL