摘要
益气扶正是中医临床治疗恶性肿瘤重要法则之一，人参作为益气扶正代表药在临床广泛应用，研究发现人参可调节免疫细胞，改善机体免疫功能，对肿瘤治疗作用机制主要是调节机体免疫系统。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAMs)是肿瘤微环境(Tumor Microenvironent,TME)中主要免疫细胞，是连接肿瘤免疫抑制状态和肿瘤进展的关键环节。因此，通过明确人参对TAMs免疫活性的调节，探讨其对肿瘤治疗的作用机制是本课题的主要研究内容。 （一）文献综述 查阅古今相关文献，从祖国医学对肿瘤微环境的认识、扶正固本法在肿瘤免疫微环境中的应用、人参对肿瘤免疫微环境的调节等三个层面综述中医药与肿瘤微环境的关系，奠定了从中医药角度研究微环境基础，同时为论文的研究内容提供可行的依据;从肿瘤微环境与肿瘤发生发展的关系、肿瘤微环境与TAMs的形成以及细胞表型特征之间的关系、TAMs的促肿瘤作用等方面进行综述，阐明肿瘤、肿瘤微环境、TAMs三者关系为后期实验设计和微环境模型的建立奠定可靠基础。 （二）TAMs模型建立与鉴定 1.三种不同条件下诱导THP-1细胞建立并优选TAMs模型。采用佛波酯(PMA)、白介素-4(IL-4)、白介素13(IL-13)诱导人急性白血病单核细胞株(THP-1)成为TAMs;三种不同条件为:PMA+5％FBS、PMA+IL-13、IL-4+5％FBS、PMA+IL-13、IL-4。细胞形态结果显示，悬浮的THP-1细胞经诱导后成为贴壁细胞，无血清调节下TAMs细胞状态欠佳，细胞密度低部分有死亡现象;Q-PCR显示巨噬细胞标志物CD68于三种条件均高表达，M1型的IL-12于含血清组低表达、M2型的IL-10于含白介素组高表达。提示，血清在诱导的过程中可能对TAMs有保护作用，白介素可以M2型标志物表达升高，因而选择模型诱导条件为PMA+IL-13、IL-4+5％FBS。 2.TAMs模型的进一步鉴定。根据优选的诱导条件诱导TAMs模型，Q-PCR技术测定TAMs细胞中M1、M2型主要标志物表达，ELISA检测TAMs细胞上清中IL-12、IL-10表达，FCM检测TAMs细胞表面标志物CD206。Q-PCR结果显示M1型标志物IL-12明显降低(P＜0.01)，M2型标志物CD206、Arg-1、IL-10、TGF-3较对照组明显升高(P＜0.01);ELISA检测模型上清中IL-12表达降低，IL-10表达升高(P＜0.01);FCM检测显示模型组标记CD206的细胞数量明显升高(P＜0.01)。结果经鉴定优选出的诱导条件下，TAMs细胞状态最佳且M2型所占比例升高，显示模型建立成功。 （三）人参及其主要成分对TAMs细胞表型的影响 1.人参质量控制与人参水提液(WEG)制备。根据药典的样品制备流程利用高效液相色谱法对饮片的质量进行控制;依据传统用药方法对人参进行煎煮，采用高效液相色谱法检测水提液中药物含量。结果显示饮片内主要的Rg1、Re、Rb1等皂苷含量符合药典要求，水提液中含有大量三种皂苷成分。 2.WEG对TAMs细胞表型的影响。以诱导成功的TAMs细胞为研究对象，Q-PCR技术筛选出WEG对TAMs表型有影响的标志物，再利用这些标志物筛选出药物最佳浓度和作用时间;ELISA技术检测WEG对TAMs的IL-12、IL-10的表达情况;Western Blot检测WEG对TAMs的CD206、iNOS的蛋白表达。结果显示Q-PCR筛选出WEG对TAMs表型有调节作用的主要标志物为IL-12、IL-10、CD206、iNOS，其中IL-12、IL-10、iNOS为高表达，CD206为低表达，筛选出WEG的最佳浓度为10mg/mL;细胞形态结果显示TAMs在高浓度WEG作用下和培养48h后状态均较差;ELISA结果显示高、中、低浓度的WEG促进IL-12的分泌且有浓度依赖性(P＜0.01)，而对IL-10的分泌无明显影响;Western Blot显示WEG能提高iNOS的表达，降低CD206的表达。提示，人参可对TAMs标志物进行调节，改变其表型特征。 3.人参主要成分(GPS、GTS)对TAMs细胞表型影响。利用Q-PCR技术检测IL-12、IL-10、CD206、iNOS的表达筛选GPS、GTS的最佳浓度和作用时间，ELISA技术检测TAMs的IL-12、IL-10的表达情况;Western Blot检测TAMs的CD206、iNOS的蛋白表达。结果显示Q-PCR筛选出GPS和GTS的最佳浓度为0.1mg/mL、0.02mg/mL，其中GPS对CD206表达无明显调节作用，GTS对iNOS表达无明显调节作用;细胞形态结果显示TAMs在高浓度药物作用下和培养48h后状态均较差;ELISA结果显示高、中、低浓度GPS和GTS均促进IL-12、IL-10的分泌;Western Blot显示GTS能明显降低CD206的表达，WEG和GTS均能升高iNOS的表达。提示，人参的两种主要成分对TAMs表型有调节作用，但调节的指标各有差异。 （四）人参及主要成分对TAMs与肿瘤细胞共培养体系中肺癌A549细胞的影响 1.建立共培养模型以及共培养体系对肺癌A549细胞增殖、迁移的影响。采用上下室和上清共培养方法，模拟肿瘤微环境构建共培养模型;显微镜观察A549细胞形态变化;采用MTT法、实时细胞分析技术(RTCA)检测分析不同条件下A549细胞的增殖、迁移和骨架蛋白F-actin表达情况。结果细胞形态图显示，共培养组A549细胞细胞密度变大，有较多新生细胞;MTT结果显示A549细胞增殖明显，上下室共培养增殖大于上清共培养方法;RTCA结果显示共培养组A549细胞迁移能力增强。提示，将TAMs与A549细胞共培养，模拟肿瘤免疫微环境，促进了肿瘤细胞的生物学行为。 2.人参及其主要成分对共培养体系中肺癌A549细胞增殖的影响。采用MTT法检测人参对A549细胞、两种共培养模型中A549细胞的增殖;显微镜观察各条件下A549细胞的形态图。结果显示，WEG促进A549增殖，在共培养体系中能有效抑制A549细胞增殖;GPS促进A549增殖，在共培养体系同样促进A549细胞增殖;GTS抑制A549增殖，在共培养体系中对A549细胞也有抑制作用。提示，WEG可能通过调节TAMs而对A549细胞有抑制作用，GTS对A549的抑制多为细胞毒性作用。 3.人参及其主要成分对共培养体系中肺癌A549细胞转移的影响。实时细胞分析技术(RTCA)、高内涵细胞成像系统(HCS)检测分析人参对共培养条件下A549细胞迁移和骨架蛋白F-actin表达情况。结果显示，WEG、GPS给药组能有效抑制A549细胞迁移能力，减少细胞骨架面积和微丝条数;GTS给药组对A549细胞迁移能力无抑制作用，细胞骨架面积和微丝条数均无影响。提示，WEG、GPS可调节微环境抑制A549细胞迁移能力，而GTS则对A549细胞迁移无影响，说明GTS对肿瘤的转移可能无调节作用。 综上所述，人参可能通过调节TAMs的免疫活性而抑制肿瘤的生物学行为，其主要成分多糖可能对肿瘤的迁移有调控作用，而皂苷成分则主要对增殖有调控作用。提示人参对肿瘤的治疗作用，可能是通过调节其免疫微环境。
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