虎斑乌贼神经肽LFRFamide、GnRH和FMRFamide基因克隆与组织表达定位分析

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中文摘要：虎斑乌贼(Sepia pharaonis)是重要的经济头足类，在海洋生态系统中占有重要地位。其肉质新鲜可口，富含丰富的营养元素，还具有潜在的药用价值，经常食用对提高身体的免疫力有重要作用。但是自20世纪80年代以来，由于过度捕捞和海域生态环境恶化，虎斑乌贼自然资源遭到极大破坏，并开始出现衰退现象。神经肽LFRFamide、GnRH和FMRFamide是三种由神经内分泌组织分泌产生小分子多肽，可能具有生殖调控等多种功能。基于LFRFamide、GnRH和FMRFamide可能参与乌贼的生殖等多种调控。本文以虎斑乌贼为研究对象，克隆三种神经肽基因的核心序列，并利用RACE技术扩增LFRFamide、GnRH和FMRFamide的3'端序列和5'端序列，通过序列拼接软件获得基因全长并对序列进行分析。采用荧光定量PCR的方法，检测3个不同发育阶段的雌、雄虎斑乌贼LFRFamide、GnRH和FMRFamide基因在不同组织的表达特异性，并利用原位杂交技术对虎斑乌贼三个基因mRNA在脑组织中的表达位点进行定位。虎斑乌贼神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(open reading frame，ORF)567bp，编码188个氨基酸，5'非编码区(5'-UTR)91bp，3'非编码区(3'-UTR)202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点（pI)为9.40。前体蛋白包含一段长22个氨基酸的信号肽和4种不同拷贝数的成熟多肽产物:1拷贝的六肽NSLFRFamide、3拷贝的六肽GNLFRFamide、1拷贝的五肽TIFRFamide、1拷贝的七肽PHTPFRFamide。成熟多肽C-端Phe-Arg-Phe(FRF)残基较为保守，构建进化树分析后将其归属到LFRFamide亚族。荧光定量PCR结果显示LFRFamide基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著表达，在视叶中亦有表达。不同是的，LFRFamide在Ⅳ、Ⅴ期雌性乌贼缠卵腺、副缠卵腺以及卵巢中有微量表达。原位杂交方法检测出LFRFamide基因在乌贼脑的食道上神经团中的脑亚脚叶(subpedunclelobe，SPL)、亚垂直叶(subvertical lobe，SVL)、前基叶(anterior basal lobe，ABL)、后基叶(posterior basal lobe，PBL)和上额叶(superior frontal lobe，SFL)，食道下神经团的(subraoesophageal mass，SEM)的前足叶(anterior pedal lobe，APL)和腕神经叶(brachial lobe，BL)、前色素细胞叶(anterior chromatophore lobe，ACL)、巨细胞叶(magnocellular lobe，MAG)、外套内脏叶(palliorisceral lobe，PVL)以及视叶中有表达。根据以上实验结果初步推测LFRFamide可能参与调控色素囊变化、取食和生殖活动。虎斑乌贼GnRH基因cDNA全序列长432bp，ORF273bp，编码90个氨基酸，5'-UTR86bp，3'-UTR73bp。ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽:pQNYHFSNGWHPG。预测前体蛋白MW为10.1kDa，pI为7.73。GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支。通过荧光定量PCR方法检测出神经肽GnRH基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，Ⅲ期时，GnRH在视叶中微量表达，Ⅴ期时，GnRH在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。原位杂交结果显示GnRH基因在乌贼脑的食道上神经团中的SVL、SPL、ABL、PBL和下额叶(inferior frontal lobe，IFL)，食道下神经团的MAG、PVL、ACL、足叶(pedallobe，PL)和腕神经叶BL，以及视叶中有表达。根据以上数据推测GnRH可能参与调控虎斑乌贼生殖活动。 FMRFamide基因cDNA序列全长约1856bp，ORF996bp，编码331个氨基酸，5'-UTR334bp，3'-UTR526bp，前体蛋白预测MW38.7kDa，pI9.09。FMRFamide氨基酸序列比对发现虎斑乌贼FMRFamide基因与曼氏无针乌贼和商乌贼核酸序列同源性最高，相似度均为97％，根据系统进化树分析虎斑乌贼与曼氏无针乌贼、商乌贼、位于同一进化分支，该结果与传统的分类方法一致。对三个不同发育阶段的雌、雄虎斑乌贼进行荧光定量PCR组织特异性，结果显示，雌、雄2种性别的虎斑乌贼FMRFamide基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著性表达，不同是的，Ⅲ期时，FMRFamide在视叶中微量表达，Ⅴ期时，FMRFamide在雌性乌贼缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。原位杂交实验结果显示在食道上神经团的SVL、SPL、ABL、PBL和IFL中能够观察到不同强度的阳性杂交信号，食道下神经团的APL、PPL、BL、ACL、MAG、PVL，以及视叶中也均能观察到有效的阳性杂交信号。根据其分布位点初步预测FMRFamide在虎斑乌贼的取食、消化、生殖调控等方面有重要作用。本研究首次克隆了虎斑乌贼神经肽LFRFamide、GnRH和FMRFamide3个基因的cDNA全长序列，并分别对Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的雌性和雄性乌贼进行3种神经肽基因的组织表达特异性分析，并对其mRNA在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞定位。本实验初步研究了3种神经肽对虎斑乌贼的生殖调控作用，研究结果将为虎斑乌贼的种质资源保护和人工繁育提供一定的理论基础。

作者：

孙连莲

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关键词：

虎斑乌贼神经肽 LFRFamide基因 GnRH基因 FMRFamide基因基因克隆基因表达

授予学位：

硕士

学科专业：

海洋生物学

导师：

迟长凤

学位年度：

2016

学位授予单位：

浙江海洋大学

语种：

中文

中图分类号：

Q95