摘要
目的：在本研究中,我们利用美国明尼苏达大学Hormel研究院由老姜根中提纯的姜提取物(Ginger extract)进行研究,其主要成分包括6-Gingerol、8-Gingerol、10-Gingerol和6-Shogaol.我们发现姜提取物可以LTA4H和AKT通路抑制结肠癌细胞的锚定非依赖性生长和细胞增殖,诱导结肠癌细胞的凋亡.计算机模拟技术显示姜提取物可以同时和LTA4H和AKT竞争性的结合在疏水性的ATP"口袋"从而发挥抑制作用.并且下调结肠癌细胞中LTA4H和AKT的基因,可以抑制结肠癌细胞的增殖和锚定非依赖性生长. 第一章 姜提取物抑制结肠癌细胞的细胞增殖及锚定非依赖生长 方法：1.自主研发合成姜提取物. 2.细胞毒性试验：检测姜提取物对正常结肠上皮细胞(HCEC)的毒性. 3.软琼脂克隆形成实验：研究生姜提取物对结直肠癌细胞不依赖贴壁生长的影响. 4.MTS法：检测姜提取物对结肠癌细胞活性的影响. 结果：1.由老姜中提取出来,能够同时抑制LTA4H和AKT激酶活性的化合物姜提取物 2.姜提取物对正常结肠上皮细胞HCEC无明显的毒性作用 MTS结果显示：正常结肠上皮细胞(HCEC)在不同浓度梯度的姜提取物加药24h或者48h后,与0μg/ml姜提取物相比较,492nm处吸光度无明显降低,提示姜提取物对HCEC无明显毒性. 第二章 姜提取物诱导结肠癌细胞的凋亡和调控结肠癌细胞的周期 方法：1.流式细胞仪检测姜提取物对结肠癌细胞凋亡的影响. 2.流式细胞仪检测姜提取物对结肠癌细胞周期的调控. 3.不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞,Western blot检测其对凋亡信号的影响. 4.不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞,Western blot检测其对周期信号的影响. 结果：1.姜提取物诱导结肠癌细胞凋亡 流式细胞仪检测结果显示：不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞72小时后,0μg/ml姜提取物仅能诱导8.5%的细胞凋亡.而用40μg/ml姜提取物处理结肠癌细胞DLD1和HCT1572小时后,结果显示能够诱导83.68%的细胞凋亡,差异显著(p<0.01). 2.姜提取物调控结肠癌细胞周期 流式细胞仪检测结果显示：不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞72小时后,姜提取物0μg/ml使细胞阻滞在S期.而随着姜提取物浓度的逐渐增加至40μg/ml处理结肠癌细胞DLD1和HCT1572小时后,细胞周期阻滞在G1期. 第三章 LTA4H和AKT在人结直肠癌组织和结肠癌细胞中高表达 方法：1.Western blot检测LTA4H和AKT在不同的结肠癌细胞系DLD1和HCT15中的表达情况,并且以正常结肠上皮细胞HCEC作为对照. 2.在人结肠癌组织中通过免疫组化法检测LTA4H和AKT的表达情况. 3.结肠癌细胞在姜提取物处理72h后,用Western blot检测其对LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平的影响. 结果：1.与正常结肠上皮细胞相比,LTA4H和AKT在结肠癌细胞系中高表达 Western blot结果显示：与正常的结肠上皮细胞HCEC相比,LTA4H和AKT在不同的结肠癌细胞系中均呈现高表达状态. 2.LTA4H和AKT相对于结肠癌癌旁正常组织,在结肠癌组织中呈高表达状态 免疫组化结果显示：LTA4H和AKT相对于结肠癌癌旁正常组织,在人结肠癌组织中呈高表达状态,且差异性显著(p<0.01). 第四章 姜提取物在体外结合并抑制LTA4H和AKT的活性 方法：1.利用超级计算机技术模拟化合物姜提取物与靶标蛋白LTA4H和AKT的相互作用. 2.利用蛋白下拉实验检测姜提取物与LTA4H和AKT在细胞水平的相互作用. 结果：1.姜提取物与LTA4H或者AKT蛋白的ATP结合区域相结合 超级计算机模拟实验证明：姜提取物与LTA4H和AKT的ATP结合口袋存在相互作用,能与这一结构结合形成复合物. 2.姜提取物与LTA4H和AKT蛋白在细胞水平结合 Pull down实验证明：姜提取物能与LTA4H和AKT相互作用,形成复合物. 第五章 下调LTA4H和AKT的表达能够抑制结肠癌细胞DLD1的克隆形成和细胞增殖,同时促进结肠癌细胞的凋亡,调控细胞周期. 方法：1.利用针对LTA4H和AKT的shRNA,包装出逆转录病毒,感染结肠癌细胞DLD1,从而下调LTA4H和AKT的表达.DLD1细胞被Western Blot检测不同的shRNA对LTA4H和AKT下调的效果,以β-actin作为上样对照. 2.软琼脂集落下调LTA4H和AKT的表达后对结肠癌细胞DLD1克隆形成的影响. 3.MTS检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞DLD1增殖能力产生的影响. 结果：1.用shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)分别包装的逆转录病毒成功调低结肠癌细胞DLD1中的LTA4H和AKT表达 Western Blot结果显示：用shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)分别包装的逆转录病毒感染DLD1细胞系,LTA4H和AKT的表达水平与对照组相比明显下降,以β-actin作为上样对照. 2.shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)的DLD1细胞组克隆形成数明显少于shmockDLD1细胞组数目. 软琼脂集落实验结果显示：调低LTA4H和AKT的表达后,shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)细胞组能够明显抑制结肠癌细胞DLD1的非依赖性生长,跟shmock细胞组相比,克隆数目明显减少(p<0.01). 第六章 下调LTA4H和AKT的表达能够抑制结肠癌细胞HCT15的克隆形成和细胞增殖,同时促进结肠癌细胞的凋亡,调控细胞周期. 方法：1.利用针对LTA4H和AKT的shRNA,分离出逆转录病毒,促使感染结肠癌细胞HCT15,进一步影响下调LTA4H和AKT的表达.Western Blot检测不同的shRNA对LTA4H和AKT调低的效果,以β-actin作为上样对照. 2.软琼脂集落形成实验检测下调LTA4H和AKT的表达后对结肠癌细胞HCT15克隆形成的影响. 3.MTS检测下调LTA4H和AKT的表达后,能够对结肠癌细胞HCT15增殖能力的影响. 4.流式细胞仪检测下调LTA4H和AKT的表达后,能够对结肠癌细胞HCT15凋亡的影响. 5.流式细胞仪检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞HCT15周期的影响. 结果：1.用shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)分别包装的逆转录病毒成功调低结肠癌细胞HCT15中的LTA4H和AKT表达. Western Blot结果显示：用shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)分别包装的逆转录病毒感染HCT15细胞系,LTA4H和AKT的表达水平与对照组相比明显下降,以β-actin作为上样对照. 2.shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)的HCT15细胞组克隆形成数明显少于shmockHCT15细胞组 软琼脂集落形成实验结果：下调LTA4H和AKT的表达后,shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(shLTA4H#2+shAKT1#793)细胞组能够显著抑制结肠癌细胞HCT15的锚定非依赖性生长,跟shmock细胞组相比,克隆数目明显减少(p<0.01). 结论：1.姜提取物作为本实验室提取的一种混合物,通过计算机模拟、体外水平及细胞水平的研究结果证实：姜提取物直接作用于LTA4H和AKT的ATP结合区域上,与LTA4H和AKT结合,通过ATP竞争抑制的方式使结合区域失活,从而达到抑制其下游信号转导通路,起到抑制结肠癌细胞的生长和增殖的作用. 2.从分子水平与细胞水平实验结果我们可以看到,两者结论相一致.姜提取物能够有效抑制结肠癌细胞的生长和增殖,且无明显毒副作用.这为结肠癌的分子靶向治疗提供了新的治疗选择.
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