摘要
目的： 心血管疾病（cardiovascular disease，CVDs）是严重威胁人类健康的常见慢性疾病，动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是CVDs的主要病理原因。近年来的研究表明，AS的发病机制部分是由表观遗传机制异常所致。由于叶酸在体内的活性形式可作为甲基的供体参与一碳代谢，叶酸缺乏被认为是导致CVDs的可能因素。然而叶酸水平与人群患CVDs的风险之间的关系仍存在争议。我们假设叶酸水平的升高可能通过表观基因沉默机制来发挥抗动脉粥样硬化作用，通过ApoE-/-小鼠AS模型及ox-LDL损伤HUVEC模型，探讨叶酸是否通过调节特定的AS相关及氧化应激相关基因DNA甲基化模式从而改善AS的病理发展，为叶酸防治AS提供科学依据和新的思路。 方法： ApoE-/-小鼠AS模型应用高脂喂养24只4周龄雄性纯合子ApoE-/-小鼠及8只同周龄C57BL/6J小鼠构建AS模型，将小鼠分为四组，采用饲料中叶酸缺乏及叶酸灌胃的方法进行干预20周。留取血清血浆、主动脉窦及主动脉弓组织，采用油红O染色及HE染色方法测定主动脉窦及主动脉弓内斑块发生发展情况；体外HUVEC损伤模型：以不同浓度ox-LDL刺激HUVEC，检测细胞活力及MDA水平，确定模型ox-LDL干预剂量；采用MTS法检测不同叶酸剂量（0nmol/L-1000nmol/L）干预对ox-LDL损伤HUVEC模型细胞活力的影响，并观察细胞形态学变化。采用化学发光免疫法检测叶酸干预后小鼠血清及细胞内叶酸浓度，采用高效液相法检测血浆及细胞内Hcy、SAM和SAH浓度，采用Elisa法检测主动脉组织及细胞内DNMTs活性，采用RT-PCR的方法检测主动脉组织及细胞内DNMTs、MCP1、VEGF和VPO1mRNA表达，分别采用免疫组化法及Western Bolt法检测主动脉组织及细胞中DNMTs、MCP1、VEGF和VPO1蛋白表达，采用焦磷酸测序法检测主动脉组织及细胞内MCP1、VEGF和VPO1启动子片段甲基化水平的变化；并采用DNMTs抑制剂5-AZA在ox-LDL损伤HUVEC模型对叶酸作用途径进行验证；采用流式细胞术检测细胞ROS及细胞凋亡率，采用免疫荧光及Elisa法检测小鼠主动脉组织及细胞内8-OH-dG含量，采用免疫组化法测定小鼠主动脉中细胞凋亡的位置及程度。 结果： 1.构建叶酸干预AS模型：（1）采用高脂喂养ApoE-/-小鼠20周可成功建立AS动物模型；叶酸添加组与叶酸缺乏组小鼠相比斑块面积减小，血清TC、LDL-C水平降低（P＜0.05），其中平均主动脉窦油红O染色面积百分比与平均主动脉弓HE染色面积百分比分别减小了约3/5和4/5；（2）ox-LDL浓度为120μg/mL时细胞活力抑制率最接近50%；中高叶酸添加（500-1000nmol/L）可以显著提高ox-LDL损伤HUVEC模型的细胞活性（P＜0.05）。 2.叶酸基于甲基化代谢对MCP1及VEGF表达影响：叶酸添加在ApoE-/-小鼠及HUVEC损伤模型中，提高血清及细胞内叶酸含量；与叶酸缺乏组相比叶酸添加降低血浆及细胞内Hcy，SAH含量，升高SAM/SAH比值（P＜0.05）；提高主动脉组织及细胞内DNMTs活性（P＜0.05），使DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达不同程度的升高，提高MCP1和VEGF启动子片段中部分CpG位点甲基化水平，抑制MCP1和VEGF在主动脉中表达（P＜0.05）；5-AZA与叶酸共同作用明显降低细胞内DNMTs活性和总甲基化水平（P＜0.05），升高MCP1表达。 3.叶酸通过DNA甲基化-氧化应激途径改善内皮功能：HUVEC损伤模型中添加500nmol/L叶酸提高VPO1启动子片段中部分CpG位点甲基化水平，抑制VPO1在细胞中表达（P＜0.05）；叶酸补充降低ApoE-/-小鼠血清中MDA和ox-LDL的含量，提高SOD的活性（P＜0.05），降低细胞中MDA和LDH的含量，升高了细胞T-AOC能力、SOD活性和GSH-Px活性；中高叶酸添加（500-1000nmol/L）降低HUVEC损伤模型细胞内ROS含量（P＜0.05）；降低主动脉及细胞中8-OH-dG含量及细胞凋亡率（P＜0.05）。 结论： 叶酸补充首先通过提高甲基化潜力，增强总DNMTs活性，升高细胞的总甲基化水平，提示叶酸通过蛋氨酸循环调节甲基化代谢。其次，叶酸通过提高MCP1、VEGF和VPO1基因启动子片段甲基化水平，引起基因表达静默；减少体内ROS积累，减轻氧化应激及DNA损伤状态，抑制AS模型中细胞凋亡程度，改善血管内皮功能，延缓AS的发生发展。研究结果明确了叶酸在AS模型中干预的特定基因，对于探讨叶酸通过DNA甲基化-氧化应激机制改善AS的作用机制提供科学依据，为使用叶酸作为营养辅助物来预防高危人群的AS提供新的见解和理论基础。
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