摘要
目的：制备与表征硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒(vincristinesulfate apoferritin nanoparticles,VCR-APO-NPs),考察此载药铁蛋白纳米粒体内外跨越血脑屏障能力并研究其对脑胶质瘤体内外靶向性及抗肿瘤效应,为纳米给药制剂治疗脑胶质瘤研究提供理论基础. 方法：采用pH梯度法制备硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒,用高效液相测定硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒的包封率,在单因素考察的基础上用L9(33)正交试验优化最佳制备工艺,以包封率为评价指标;用透射电镜观察硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒的形态,激光粒度仪测定粒径大小及Zate电位,透析法考察硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒在pH7.4及pH5.0的体外环境中的释放情况,并计算出溶出曲线拟合方程;以C6(鼠源神经胶质瘤细胞)细胞为体外模型,用激光共聚焦观察铁蛋白纳米粒的体外细胞摄取及肿瘤球穿透实验,利用四种内吞抑制剂作用于C6细胞并用激光共聚焦及流式细胞仪考察C6细胞的内化机制;以bEnd.3/C6共培养方式建立体外血脑屏障细胞模型,考察制剂的体外跨BBB情况,同时用哺乳动物斑马鱼作为跨体内血脑屏障研究模型,用激光共聚焦进行实时观测;用MTT法考察硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒的体外抗C6细胞的增殖能力,并用酶标仪进行检测;采用C6细胞建立小鼠原位脑胶质瘤原位模型,cy5.5为荧光探针标记铁蛋白纳米粒,用小动物活体成像仪实时观测cy5.5-APO的体内分布情况;考察给药后小鼠的体重变化、抑瘤率及绘制生存曲线,最后用核磁检测荷瘤小鼠脑部肿瘤体积大小及通过病理切片检测考察硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒对脑胶质瘤的治疗作用. 结果：采用pH梯度法制备硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒,最佳制备工艺为：搅拌速度350rpm,搅拌时间60min,聚合时的pH值7.4,并根据最佳制备工艺制备出的三批样品测得其包封率为(39.49±0.36)%,载药量为(1.45±0.28)%,硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒的外观为乳白色,透射电镜观察硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒的形态为类球形,粒径为(26.41±0.42)nm,Zeta电位为(-20.30±0.81)mV.在7天内制剂稳定性良好,在pH7.4及5.0释放介质的环境中制剂体外36h分别累积释放量为(16.50±1.18)%和(68.90±1.76)%,且释放符合Weibull模型的释放规律(R=0.9660,R=0.9759).体外细胞实验证明,铁蛋白纳米粒可以被C6及bEnd.3细胞摄取,可以穿透C6肿瘤球到达球心位置,通过四种内吞抑制剂验证C6细胞的摄取机制是通过小窝蛋白介导的内吞,同时伴有巨胞饮途径,且整个过程是能量依赖的.体外血脑屏障模型及斑马鱼实验均证实铁蛋白纳米粒可以有效跨越血脑屏障.硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒对C6肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用.用C6细胞进行的小鼠脑胶质瘤原位模型建立成功,在尾静脉注射cy5.5-APO后,在2h时脑部检测到很强的荧光信号,在4h时仍有信号强度,与游离cy5.5组相比,cy5.5-APO在脑内有较强的蓄积能力.体外抗肿瘤结果表明,硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒可以明显延长小鼠的生存期,中位生存时间为31天,体重下降趋势也明显低于对照组,抑瘤率可达(89.72±3.69)%.核磁学检测和病理切片结果显示,VCR-APO能明显减少小鼠脑肿瘤体积和观察到更少更稀疏的肿瘤细胞. 结论：采用pH梯度法制备的硫酸长春新碱铁蛋白纳米粒粒径能达到设计的要求,形态圆整,包封率、载药量都比较好,稳定性良好,在酸性环境中有利于药物的释放.制剂可以被C6细胞及bEnd.3细胞摄取、可穿透C6细胞肿瘤球,能成功跨越血脑屏障,在体内具有脑靶向性及对小鼠脑胶质瘤具有明显的治疗效果,为硫酸长春新碱制剂治疗脑胶质瘤提供理论依据.
NETL