摘要
肝癌（liver cancer，LC）的年死亡率在恶性肿瘤中居第二、发病率居全球第五位，2012年约有782，500个新增肝癌病例和745，500肝癌死亡病例，这些病例中约有50%来自于中国(1,2)。原发性肝癌的临床特点为隐匿性起病、进展非常迅速、预后极其差，严重威胁中国及世界人民的身体健康。因此积极寻找新的治疗方向是目前中国乃至全球肝癌诊治中的重要任务。 近期研究发现β肾上腺素能受体（β-adrenegic receptor，β-AR）信号通路与多种肿瘤的发生和发展密切相关，尤其以β2肾上腺素能受体信号通路为主，参与了肿瘤发生和发展的多个过程，包括炎症、血管生成、细胞凋亡及失巢凋亡、细胞免疫应答、细胞的运动及细胞自噬等，与肿瘤的发生和发展、肿瘤的生长和转移密切相关(3)。 β肾上腺素能受体信号通路也参与了肝癌的发生发展过程。中国肝癌多是在肝硬化尤其是乙肝肝硬化基础上发展而来，而肝硬化患者交感神经系统活性升高、去甲肾上腺素及肾上腺素的含量明显升高，存在儿茶酚胺代谢紊乱。非选择性β受体阻滞剂(non-selective beta blocker,NSBB)可能作为抗肝硬化患者肿瘤生成药物有独到之处。肝脏炎症促进肿瘤生成，非选择性β受体阻滞剂减少细菌移位，因此减少来自于肠道的前炎症细胞因子进入肝脏。非选择性β受体阻滞剂抑制驱动肿瘤细胞的迁移、肿瘤血管生成、侵袭和增生的儿茶酚胺。非选择性β受体阻滞剂是抗血管源性的，因此可以抑制肝癌生长。一项临床meta分析也显示非选择性β受体阻滞剂减少肝硬化患者的死亡率，不仅仅是通过减少胃肠道出血率可以解释的，一部分好处可能在于降低肝癌的发生率。 盐酸普萘洛尔（propranolol hydrochloride，PPL）是中国《肝硬化伴食管胃静脉曲张破裂出血临床指南》中推荐的降低门静脉压力、预防食管胃静脉曲张破裂出血的一级预防用药。盐酸普萘洛尔除了传统的治疗高血压、心律失常、缺血性心脏病等疾病外，近来研究发现普萘洛尔有抑制血管生成过程、诱导微血管内皮细胞的凋亡等作用机制，对处于增殖期与消退期的婴幼儿血管瘤均有显著疗效，已被国内外指南推荐为婴幼儿血管瘤治疗的一线药物(4)。40多年临床实践证实盐酸普萘洛尔安全、耐受性好，因其对β-AR尤其是β2-AR的阻断作用，在肿瘤的治疗中应有进一步的发展。 本研究拟给予肝癌细胞不同浓度的盐酸普萘洛尔，来观察盐酸普萘洛尔可否抑制肝癌细胞的细胞增殖。以正常人肝细胞株为对照来选择盐酸普萘洛尔最合适的用药浓度：这个浓度可抑制肝癌细胞的增殖，同时不影响正常肝细胞的细胞增殖。同时，拟检测是否肝癌细胞表面β受体较正常肝细胞的表达水平升高，以期确定盐酸普萘洛尔通过是否通过对β受体信号通路的作用介导对肝癌细胞生长的调控。观察盐酸普萘洛尔对肝癌细胞的迁移和侵袭性是否有影响。接下来，将重点研究盐酸普萘洛尔导致的肝癌细胞的死亡是否通过细胞凋亡或是细胞自噬实现，并探讨盐酸普萘洛尔在细胞凋亡和细胞自噬中的作用机制。本研究可初步探讨β受体信号通路在肝癌细胞增殖和死亡中的作用机制，并以正临床广泛应用的药物—盐酸普萘洛尔为研究对象进行机制探讨，可以为盐酸普萘洛尔在临床抗肿瘤治疗方面提供基础实验依据，为临床药物治疗肝癌提供辅助治疗的新思路，本研究内容目前在国内外鲜有报道。 方法： 1.通过免疫荧光检测、Western Blot技术和q RT-PCR技术来观察不同的肝癌细胞株表面的β受体分布情况；同时观察给予不同浓度盐酸普萘洛尔后肝癌细胞株β受体的改变，阐明盐酸普萘洛尔是否通过β受体对肝癌细胞产生影响； 2.通过IncuCyteZoom长时间动态成像及分析系统动态观察给予不同浓度的盐酸普萘洛尔后肝癌细胞及正常肝细胞的细胞增殖情况；流式细胞术检测死亡细胞比例，使用盐酸异丙肾上腺素研究体外阻断β受体信号通路后对肝癌细胞增殖及存活能力的影响； 3.通过特异性的β2受体抑制剂ICI118,551和特异性的β2受体激动剂福莫特罗观察其对肝癌细胞增殖情况，研究盐酸普萘洛尔对于肝癌细胞增殖的抑制是否主要通过β2受体来实现。 4.通过划痕实验，利用IncuCyteZoom长时间动态成像及分析系统观察盐酸普萘洛尔对于肝癌细胞迁移和细胞侵袭的影响。 5.通过DAPI染色、Hoechst33342/PI染色技术观察盐酸普萘洛尔对肝癌细胞凋亡的形态学影响；利用流式细胞技术Annexin V/PI双染定量检测盐酸普萘洛尔对肝癌细胞细胞凋亡数的影响； 6.利用流式细胞术检测盐酸普萘洛尔对肝癌细胞周期的影响； 7.利用免疫荧光JC-1检测盐酸普萘洛尔对凋亡细胞线粒体膜电势的影响；利用Western Blot技术来研究盐酸普萘洛尔阻断β受体信号通路后对肝癌细胞凋亡的机制探讨； 8.通过ICI118,551和福莫特罗观察β2受体信号通路对盐酸普萘洛尔诱导的肝癌细胞凋亡的影响； 9.利用免疫荧光染色及Western Blot观察盐酸普萘洛尔对肝癌细胞自噬的诱导；转染stubRFP-sensGFP-LC3的慢病毒进入肝癌细胞，检测盐酸普萘洛尔在细胞自噬过程中自噬流的变化； 10.通过ICI118,551和福莫特罗观察β2受体信号通路是否参与盐酸普萘洛尔诱导的肝癌细胞自噬； 11.利用Western Blot技术研究盐酸普萘洛尔对细胞自噬相关蛋白的变化，探讨可能的作用机制； 12.利用凋亡抑制剂Z-VAD、自噬抑制剂3-MA、自噬激活剂雷帕霉素，通过Western Blot技术、免疫荧光技术等方法来探讨盐酸普萘洛尔诱导的肝癌细胞凋亡和细胞自噬之间的相互关系。 结果： 1.肝癌细胞中β肾上腺素能受体表达升高，以β2受体为主，盐酸普萘洛尔通过降低β肾上腺素能受体抑制肝癌细胞增殖。 2.盐酸普萘洛尔主要通过阻断β2肾上腺素能受体发挥抑制肝癌细胞的增殖作用。 3.盐酸普萘洛尔可以抑制肝癌细胞迁移和侵袭。 4.盐酸普萘洛尔能够诱导肝癌细胞凋亡，主要通过阻断β2肾上腺素能受体信号通路发挥作用。 5.盐酸普萘洛尔通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡。 6.盐酸普萘洛尔能够诱导肝癌细胞自噬，增加自噬流的产生。 7.盐酸普萘洛尔通过阻断β肾上腺素能受体信号通路负向调节细胞自噬。 8.盐酸普萘洛尔引起的肝癌细胞的凋亡和自噬之间互相制约。 结论： 本研究以肝癌细胞为研究对象，证明了盐酸普萘洛尔可以通过对β肾上腺素能受体的作用控制肝癌细胞的生长。通过实验，发现，一方面，β肾上腺素能受体的确在肝癌细胞中表达升高，使用非选择性β肾上腺素能受体阻断剂盐酸普萘洛尔可以通过对β肾上腺素能受体的作用抑制肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞迁移及侵袭；另一方面，盐酸普萘洛尔可以同时诱导肝癌细胞凋亡和自噬，二者相互拮抗。我们的研究首次全面分析报道了盐酸普萘洛尔在体外对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡和细胞自噬的作用，并初步探讨了其作用机制。这为β肾上腺素能受体信号通路在肝癌发生机制的基础研究提供了线索，同时也为临床探索肝癌药物辅助疗法（盐酸普萘洛尔的抗肿瘤作用）找到了新的方向。 创造性成果：盐酸普萘洛尔体外可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，可诱导肝癌细胞凋亡和细胞自噬，具有抗肿瘤作用。 新见解：盐酸普萘洛尔有抗肝癌作用。
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