摘要
多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是一种淡水和咸淡水寄生原生动物，属纤毛虫纲(Oligohymenophorea)、凹口科(Ophryoglenidae)、小瓜虫属(Ichthyophthirius)，其生活史分为成虫期（滋养体期）、包囊期和感染幼虫期三个阶段。该虫主要寄生在鱼鳃、鱼鳍和皮肤上，导致寄生处上皮细胞增生，出现许多小白点，因此又称“白点病”。该病分布广泛，遍及全球，周年发生，我国每年4月~6月和9月~11月(水温为20℃~24℃)是小瓜虫病的流行盛期。多子小瓜虫对寄主无严格选择性，主要危害鱼苗和鱼种，发病快、死亡率高、难治愈。过去几十年主要用汞制剂和孔雀石绿防治小瓜虫病，取得了良好效果，但由于这些药残留高，毒性大，具有致癌致畸作用，已被各国政府禁止使用。目前缺乏安全有效的防治小瓜虫病的药物。因此，研究开发杀灭小瓜虫的安全、高效、环保的新型绿色渔药迫在眉睫。 我国有着广阔的中草药资源和使用中草药治疗疾病的悠久历史。其毒副作用小，易降解，残留低，环境友好。近年来，中草药在水产动物病害防治中使用越来越广泛，但是，存在很大盲目性，主要借鉴中草药在人畜疾病治疗中的经验，中草药防治水产疾病的相关研究严重滞后，极大地影响了防治疾病的效果和技术的推广。迫切需要开展中草药防治水产疾病的系统研究，开发出安全、高效、质量可控的源自中草药的新型环保渔药。本研究从110种中草药通过杀小瓜虫活性初筛具有杀虫作用的植物种类，采用活性追踪法，分离纯化鉴定杀小瓜虫活性化合物，研究其药效、毒理、残留消除过程以及杀虫机理，结果如下： 1.杀灭多子小瓜虫的中草药植物种类筛选：通过110种中草药水提物对多子小瓜虫成虫离体杀灭效果研究，发现7种中草药对多子小瓜虫成虫具有较好的杀灭作用，其中生姜抑杀效果最好，对多子小瓜虫幼虫和成虫的最低致死浓度均为0.1g/L，致死时间分别为154±3min和202±4min，对包囊的最低致死浓度均为0.2g/L，致死时间为276±4min。5种生姜萃取物中，石油醚萃取物杀灭多子小瓜虫幼虫、成虫和包囊效果最佳，致死浓度分别为10mg/L、50mg/L和40mg/L。 2.姜油树脂杀灭多子小瓜虫活性成分的追踪、分离纯化与鉴定：依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇萃取姜油树脂，杀虫活性最佳的乙酸乙酯萃取物通过3次硅胶层析柱洗脱、反相高效液相色谱纯化、薄层层析检测以及活性追踪测定等方法，最终分离纯化得到三种活性单体化合物，结合质谱(ESI-MS)、质子核磁共振谱(1H-NMR)和核磁共振碳谱(13C-NMR)的波谱数据对其结构进行鉴定，最终确定这三种活性单体分别为10-姜酚(C21H34O4)、6-脱氢姜烯酚(C17H22O3)、6-脱氢-10-姜酚(C21H32O4)，双因素方差对比分析表明10-姜酚活性最佳。 3.10-姜酚杀灭多子小瓜虫药效研究：10-姜酚在4h内全部杀死成虫、包囊、幼虫的浓度分别为8mg/L、16mg/L和2mg/L。低浓度(1、0.5mg/L)10-姜酚处理幼虫2h，可显著降低幼虫的感染力。在体治疗和预防实验中，4mg/L10-姜酚，10天内可完全治愈轻度感染病鱼(感染率和感染强度为0，存活率为100%)。2mg/L10-姜酚可使未感染鱼接触感染性幼虫后的感染率控制在13.3%，使已被感染鱼的感染率下降至20%，且感染强度与对照组相比显著降低。 4.10-姜酚的毒理研究：10-姜酚对草鱼的LC50为85.43mg/L，分别是其对成虫EC503.38mg/L和幼虫EC500.79mg/L的25倍和108倍；对斜生栅藻生长的最低可观察效应浓度(Lowest observed effect concentration,LOEC)在20mg/L以下；对大型溞的LC50为10.2mg/L，属于低毒，无急性毒性；对大型溞的慢性毒理作用表现为，2.5、5mg/L的10-姜酚对大型溞繁殖(每雌生殖量、胎数/母溞、内禀增长率)的抑制效应呈现显著性差异，但对大型溞的生长(终点体长和蜕皮/母溞)无明显影响；注射剂中10-姜酚含量小于等于0.78mg/L，对兔子血细胞的溶血率<5%，10-姜酚对血细胞无凝集作用。 5.10-姜酚杀虫机理研究：10-姜酚对小瓜虫成虫的细胞膜有显著损伤，细胞膜穿孔后胞液大量渗出，体表纤毛断裂，线粒体萎缩卷曲，细胞质出现空泡和细胞器碎片；小瓜虫幼虫细胞膜表面结构受损，纤毛断裂，大核染色质固缩，核膜突起，细胞器受损变形，细胞水肿变圆。受10-姜酚处理的成虫和幼虫的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、三磷酸腺苷酶(Adenosine triphosphatase,ATPase)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)活力均显著降低，同时丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量升高。10-姜酚降低了小瓜虫能量代谢酶活性，造成能量缺乏，使其运动越来越慢，直至停止，同时随着虫体中毒加深，线粒体结构受损，细胞膜和其它细胞器的膜都不同程度受损，水分大量进入虫体，造成死亡。幼虫形态逐步变圆，最终胀破，成虫也变圆并逐步变得透明，最终死亡。 6.10-姜酚在草鱼体内的残留消除规律：建立了10-姜酚在草鱼主要器官组织残留的高效液相色谱检测方法(HPLC)(检测限0.5μg/g或μg/mL)和液相色谱与质谱联用检测方法(HPLC-ESI/MS)(检测限5μg/kg)。在23±0.5℃水温条件下，以200mg/kg的剂量单次腹腔注射给药研究10-姜酚在草鱼体内的残留消除规律。结果表明，给药后48h10-姜酚浓度在各器官组织达到峰值，HPLC测定血浆、肌肉、肝脏和肾脏中峰浓度分别为17.78μg/mL、18.8μg/g、23.73和20.77μg/g。10-姜酚在各组织中均在第168h(7d)低于检测限(0.5μg/g)。采用HPLC-ESI/MS检测，给药后第7d和第10d的草鱼肌肉中10-姜酚残留量为216.17μg/kg和38.78μg/kg，第15d时10-姜酚残留低于检测限(5μg/kg)。表明10-姜酚在草鱼体内吸收分布较为缓慢，消除迅速，主要代谢器官为肝脏和肾脏。 7.10-姜酚稳定性试验：采用经典恒温加速试验法，测得在室温25℃下，10-姜酚的有效期为2年，而25℃室温留样6个月的10-姜酚杀虫活性与对照间无显著性差异。 综上所述，10-姜酚具有良好的杀灭多子小瓜虫活性，同时对草鱼、浮游动植物和哺乳动物毒性低，其杀虫机制在于抑制小瓜虫关键酶活(特别是能量代谢酶活)，显著降低其能量代谢和解毒功能，造成细胞水肿和中毒，最终导致其死亡。与传统化学药物相比，10-姜酚可以克服残留、毒副作用、污染环境等缺点，具有开发成安全、高效、环保新型杀虫渔药的潜在价值。
NETL