摘要
目的： 谷氨酰胺的代谢是细胞生命活动中的重要组成部分,尤其是对于肿瘤细胞,谷氨酰胺的代谢对其生长和繁殖有着尤为重要的作用.众所周知,在肿瘤细胞中存在着不同于正常细胞的异常代谢.正常细胞在有氧条件下,糖酵解被抑制,肿瘤细胞却在氧气充足的情况下仍然优先利用葡萄糖进行糖酵解,产生大量乳酸,即Warburg效应,并且活跃地利用谷氨酰胺. 而对于谷氨酰胺在肿瘤细胞生长和繁殖中起的主要作用还不是特别清楚,现在的普遍观点认为肿瘤细胞大量利用谷氨酰胺是为了回补三羧酸循环,为细胞的生长和繁殖提供能量.而这与我们的前期研究并不相符.所以,本课题旨在研究谷氨酰胺在肿瘤细胞的生长和增殖中的主要作用,从而揭示异常谷氨酰胺代谢对于肿瘤的发生发展过程的意义. 方法： 1.利用本实验室专利方法GC3AI验证谷氨酰胺剥夺诱导的细胞死亡形式. 2.利用过表达Bcl-2家族基因中的Bcl-2、Bcl-xl看能否保护剥夺谷氨酰胺诱导的细胞死亡,看谷氨酰胺剥夺诱导的凋亡是否依赖于线粒体. 3.利用荧光素酶法测定ATP,从而反映不同细胞系增殖情况. 4.利用Z-vad、E-64、Cathepsin inhibitor等抑制剂来判断谷氨酰胺剥夺诱导的细胞凋亡的信号通路. 5.利用Western blot技术检测各种细胞系中谷氨酰胺合成酶(GLUL)的表达以及剥夺谷氨酰胺后对GLUL的诱导表达情况. 6.用过表达GLUL质粒与降表达GLUL质粒探索GLUL与肿瘤细胞生长和增殖是否有关且有怎样的关系. 7.利用大数据分析GLUL、谷氨酰胺转运体(ASCT2)与肿瘤临床预后的关系. 结果： 1.GC3AI验证谷氨酰胺剥夺诱导的细胞死亡形式为凋亡. 2.过表达Bcl-2家族基因中的Bcl-2、Bcl-xl能保护剥夺谷氨酰胺诱导的细胞凋亡,但不能恢复细胞的增殖,谷氨酰胺诱导的肿瘤细胞凋亡依赖于线粒体. 3.利用Z-vad、E-64、Cathepsin inhibitor等抑制剂作用可以看出谷氨酰胺剥夺诱导的细胞凋亡走Caspase经典凋亡途径. 4.其他19种氨基酸和三羧酸次循环中间代谢产物均不能有效的替代谷氨酰胺对于肿瘤细胞的作用. 5.腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)四种碱基则可以有效的阻止谷氨酰胺剥夺诱导的凋亡,但仍然不能恢复肿瘤细胞的增殖. 6.AGCU与其它几种氨基酸共同作用即阻止了谷氨酰胺剥夺诱导的细胞凋亡,又能够有效地恢复肿瘤细胞的增殖. 7.Western blot技术检测几种细胞系中谷氨酰胺合成酶(GLUL)的表达量有所不同,但基本均相对较低. 8.Western blot技术检测到一些细胞在剥夺谷氨酰胺后对GLUL有诱导表达得情况,一些细胞则不明显. 9.过表达GLUL后,在谷氨酰胺剥夺的情况下,加入了谷氨酸(Glu)之后,能很好地保护肿瘤细胞的死亡且能够很大程度上恢复肿瘤细胞的增殖;在降表达GLUL后,谷氨酰胺诱导的凋亡相对增加. 10.大数据分析GLUL高表达,乳腺癌患者预后较好,ACST2高表达,乳腺癌患者预后较差. 结论： 肿瘤细胞内存在异常的谷氨酰胺代谢,目前文献认为谷氨酰胺在肿瘤细胞中的一个最主要作用是回补三羧酸循环的碳源.我们的研究结果显示,谷氨酰胺主要是为合成核苷酸提供酰胺氮和合成其他非必需氨基酸提供氨基氮以保证肿瘤细胞生长.谷氨酰胺的剥夺在乳腺肿瘤细胞中会诱导谷氨酰胺合成酶(GLUL)的表达,以Glu为原料合成Gln.虽然抑制GLUL的表达可加速谷氨酰胺剥夺导致的死亡,但肿瘤组织中GLUL的高表达可能意味着肿瘤细胞面临缺乏谷氨酰胺的情况,这种状况无法保证肿瘤细胞恶性生长.因此,GLUL可能与临床上乳腺癌患者的良好预后有关,也说明肿瘤细胞要恶性生长必须从外界获得充足的谷氨酰胺.与之相应的是,谷氨酰胺转运蛋白ASCT2可能促进肿瘤的恶性进展,其高表达可能与临床上乳腺癌患者的不良预后有关.
NETL