摘要
目的： 通过夹脊电针干预ALS-SOD1G93A转基因小鼠，观察其对小鼠疾病进程和行为学的影响，并从拮抗谷氨酸兴奋性毒性为切入点探讨产生该影响的分子机制，为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。 方法： 第一部分夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠疾病进程和行为学的影响：1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：本实验以ALS-SOD1G93A转基因小鼠为实验对象，于小鼠日龄30天时，应用美国Jackson实验室提供的引物序列和方案对小鼠进行PCR鉴定，并根据病情进展观察小鼠的表型特征。2.分组及处置：ALS-SOD1G93A转基因小鼠30只，按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各10只，于小鼠日龄60天开始干预，电针组针刺双侧L1~2、L5~6夹脊穴，躯干同侧2Hz电针治疗；手针组针刺双侧L1~2、L5~6夹脊穴；模型组予以捆绑固定；20min/次，2次/周，共4周。3.神经功能评分及行为学测试：联合应用悬尾试验、称重、转棒实验来观察小鼠发病及疾病进展情况。 第二部分夹脊电针拮抗ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓神经元兴奋性毒性的机制研究：1.分组及处置：ALS-SOD1G93A转基因小鼠33只，按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各11只，同窝野生型小鼠11只作为阴性对照，电针组、手针组、模型组处置同第一部分，阴性对照组不做任何处置。2.HE染色、透射电镜：观察各组小鼠日龄120天时腰髓前角运动神经元形态学变化。3.ELISA法：检测各组小鼠日龄120天时血清谷氨酸的含量。4.免疫组化法：检测各组小鼠日龄120天时腰髓前角EAAT2、AMPA受体GluR2亚单位的表达情况。5.免疫印迹法：检测各组小鼠日龄120天时腰髓EAAT2和AMPA受体GluR2亚单位相对表达量的变化。 结果： 1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：PCR鉴定：出现两个条带的泳道对应的受检小鼠为SOD1-G93A转基因小鼠，仅出现一个条带的泳道对应的受检小鼠为同窝野生型小鼠，阳性率为40%±5%。表型特征：小鼠于日龄90天左右出现悬尾时后肢震颤或伸展无力，100-120天左右出现行动缓慢及后肢拖拽，140-150天左右小鼠完全瘫痪，不能爬行和自主进食，侧卧于垫料上。 2.体重分析：与模型组比较，电针能明显延缓小鼠体重丢失，有显著性差异（P＜0.05），手针组小鼠体重丢失亦得到一定的延缓，但无统计学意义（P＞0.05）。 3.发病时间和生存期分析：与模型组比较，电针组小鼠发病推迟了8天，有显著性差异（P＜0.05），手针组小鼠发病推迟了5天，但无显著性差异（P＞0.05）。与模型组比较，手针组、电针组小鼠生存期分别延长了5天和10天，有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）；与手针组比较，电针组小鼠生存期延长了5天，有显著性差异（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析可知，小鼠日龄147.6天时，模型组小鼠存活率明显低于手针组和电针组。 4.转棒实验分析：与模型组比较，从19周到21周，手针组和电针组小鼠转棒运动功能明显得到改善（P＜0.05，P＜0.01），且电针组改善更明显（P＜0.05，P＜0.01）。 5.形态学：①HE染色可见模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少，神经细胞结构不清、固缩，胞质胞核染色不清，核固缩，出现空泡状改变；与模型组比较，手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目增多，神经细胞结构形态有所改善，空泡化减少，且电针组效果优于手针组。②运动神经元计数：模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少（P＜0.01）；手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组增多（P＜0.05，P＜0.01），且电针组较手针组增多更明显（P＜0.05）。③透射电镜可见模型组小鼠腰髓前角神经细胞萎缩，细胞膜皱缩，线粒体不同程度肿胀，嵴出现断裂、减少，有些线粒体虽可辨认，但已呈空泡状，核膜凹陷变形或部分破裂，异染色质聚集成块，变性的神经细胞周围可见胶质细胞围绕形成卫星现象；与模型组比较，手针组和电针组小鼠腰髓前角神经细胞超微结构有所改善，且电针组改善更明显。 6.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠血清谷氨酸含量的影响：ELISA结果显示，模型组小鼠血清中谷氨酸含量显著升高（P＜0.01）；与之相比较，手针组和电针组显著降低（P＜0.01），且电针组较手针组降低更加明显（P＜0.05）。 7.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓EAAT2的影响：免疫组化染色结果显示，模型组小鼠腰髓前角EAAT2的表达显著下降（P＜0.01）；与之相比较，手针组和电针组EAAT2的表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且电针组优于手针组（P＜0.05）。免疫印迹结果显示，模型组小鼠腰髓EAAT2蛋白表达下降（P＜0.01）；与之相比较，手针组和电针组EAAT2蛋白表达显著升高（P＜0.01），且电针组较针刺组升高更明显（P＜0.01）。 8.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓AMPA受体GluR2亚单位的影响：免疫组化染色结果显示，模型组小鼠腰髓前角GluR2的表达显著下降（P＜0.01）；与之相比较，手针组和电针组GluR2的表达显著升高（P＜0.01），且电针组优于手针组（P＜0.05）。免疫印迹结果显示，模型组小鼠腰髓GluR2蛋白表达下降（P＜0.01）；与之相比较，手针组和电针组GluR2蛋白表达显著升高（P＜0.01），且电针组较手针组升高更加显著（P＜0.01）。 结论： 1.夹脊电针能够改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠的运动功能，延缓发病，延长生存期，其效果优于手针治疗。 2.夹脊电针可以改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化，其效果优于手针治疗。 3.夹脊电针通过上调ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓EAAT2的表达，降低神经元微环境中谷氨酸水平，同时通过上调腰髓AMPA受体GluR2亚单位的表达，提高神经元抗兴奋性毒性能力，其效果优于手针治疗。
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