摘要
猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）是由猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）引起的严重危害养殖的重要传染病。PCV2感染后造成机体产生强烈的免疫抑制，引起多种病原体的继发/混合感染，给 PCVD 的防控带来更大的挑战。PCV2基因组全长1767 bp或1768 bp，为闭合的单链环状DNA病毒，病毒粒子具有二十面体结构，无囊膜。PCV2在分类上属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员。PCV2基因组中存在多个开放阅读框（Open reading frame，ORF），对其编码蛋白功能的阐明是揭示病毒致病机理的基础，目前已经有6个ORFs被发现和研究。ORF1是PCV2基因组中最大的开放阅读框，编码病毒复制酶Rep和Rep’蛋白，与PCV2的复制相关。ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap，组成病毒的基本结构，在病毒感染过程中具有多种功能，参与机体的免疫应答活动。ORF3 编码的蛋白能促进宿主细胞P53蛋白大量积聚，诱导细胞凋亡的发生。ORF4编码的蛋白具有拮抗细胞凋亡的作用。ORF6编码的蛋白能够上调多种细胞因子的表达，同时也参与细胞凋亡。本研究团队发现和鉴定了PCV2基因组中的一个新的ORF，将其命名为ORF5，该ORF基因全长180 bp，编码蛋白在诱导内质网应激、细胞自噬和细胞周期调控方面可能具有重要作用，但其确切功能尚不清楚。ORF5蛋白功能的发挥离不开宿主细胞内的互作蛋白，筛选和鉴定与ORF5蛋白互作的胞内蛋白、研究其在PCV2感染中的作用，将为揭示PCV2的感染及致病机理、发现新的宿主靶点和研发防控新药物等提供更多的理论支持。 本研究通过高通量测序技术对猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages 3D4/2， PAMs）中可能与ORF5互作的蛋白进行筛选和鉴定，对获得的胞内蛋白-跨膜糖蛋白NMB前体（Transmembrane glycoprotein NMB precursor，GPNMB)在PCV2复制中的作用进行了研究，分析了其可能的作用机制。本研究获得以下结果： （1)通过高通量测序技术获得表达ORF5 蛋白（PAM-ORF5)和接种 PCV2 （PAM-PCV2）的PAMs的转录组数据。发现在PAM-PCV2和PAM-ORF5中均出现的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）共104个，其中上调为24个，下调为80个，多数参与细胞信号转导、蛋白翻译和细胞周期等生命活动。在Go功能分类中，PAM-ORF5中的上调DEGs与蛋白结合转录因子活动与连接活动的相关性最高，下调基因与代谢活动及信号活动的相关性最高。PAM-ORF5中的DEGs多数富集在病毒心肌炎、蛋白消化和吸收、扩张性心肌病等通路，PAM-PCV2中的DEGs多数富集在心肌收缩、络氨酸新陈代谢等通路，细胞周期通路为唯一的只于PAM-ORF5中富集的通路。 （2）PAM-ORF5和PAM-PCV2中均发现GPNMB出现下调，结合前期ORF5蛋白酵母双杂交互作蛋白的筛选结果，我们认为GPNMB极可能是ORF5蛋白的一个胞内互作蛋白。在PCV2感染猪的不同组织中也检测到GPNMB的表达，且与PCV2的荷载量呈现负相关。 （3）ORF5蛋白与GPNMB存在互作。通过激光共聚焦显微镜观察到ORF5蛋白与GPNMB 在细胞中存在共定位，外源和内源性的免疫共沉淀试验（Co-immuno precipitatition，Co-IP）发现 ORF5 蛋白与 GPNMB 存在相互作用，GST 蛋白沉降技术（GST-pulldown）实验进一步证实两者之间存在直接的相互作用。 （4）GPNMB对PCV2的复制具有抑制作用。通过在过表达和调低宿主细胞GPNMB的基础上，接种PCV2后检测病毒核酸和蛋白，发现GPNMB具有抑制PCV2复制的作用。GPNMB可以使宿主细胞S期进程显著缩短，细胞周期蛋白Cyclin A的表达显著上调，使细胞的周期缩短，这可能是抑制PCV2复制的一个原因。 综上所述，PCV2 ORF5能够引起宿主细胞内多种蛋白及通路异常，其相互作用蛋白GPNMB能够抑制PCV2的复制，并且这一抑制作用可能是通过促进细胞周期进程来实现。
NETL