摘要
Wnt/β-catenin通路参与机体许多重要生理活动，包括细胞命运决定、胚胎早期发育、神经系统发育、生殖系统发育以及肿瘤发生等，在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中扮演至关重要的角色。卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡以及类固醇激素的分泌依赖于 Wnt/β-catenin 通路的调控。褪黑素（Melatonin）作为一种重要的吲哚胺类激素，在神经系统发育、卵巢卵泡发育和抗肿瘤中体现出色功能。褪黑素在卵巢颗粒细胞的发育中扮演重要的调控作用。越来越多的研究结果证实Wnt/β-catenin通路参与了褪黑素在机体多个重要生理活动中的调节，但是否参与了褪黑素对卵巢颗粒细胞发育的调控仍需研究证实。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）通路参与了细胞命运决定，调控高等生物神经系统发育和卵巢发育等重要生长发育活动，同时也与一些人类疾病，包括糖尿病、阿尔茨海默病甚至癌症等紧密关联。Wnt/β-catenin通路与PI3K/Akt通路在肿瘤形成和许多其它生理活动中的互作被越来越多的研究结果证实，但目前尚无文献报道Wnt/β-catenin通路与PI3K/Akt通路在调控卵巢发育活动中的互作关系。 本试验通过特异的小分子通路抑制剂调控Wnt/β-catenin通路和PI3K/Akt通路信号，利用Western Blot、实时定量PCR、CCK-8法等多种检测方法，着重探究Wnt/β-catenin通路与褪黑素、Wnt/β-catenin 通路与 PI3K/Akt 通路在猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌等生理活动中的关系与功能，证实猪卵巢颗粒细胞发育中新的调控方式，为后续具体调控机制的研究做好先期验证和理论参考。试验主要获得如下结果： 1. Wnt/β-catenin通路对猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡的影响 添加不同浓度（DMSO，1，5，10，20，30 μM）Wnt/β-catenin通路抑制剂IWR-1-endo处理猪卵巢颗粒细胞48 h，CCK-8法检测细胞活力，Western Blot检测细胞β-catenin蛋白含量，实时定量PCR检测基因表达。结果揭示，5 μM IWR-1-endo处理颗粒细胞，显著地降低细胞活力，降低β-catenin蛋白含量；显著地抑制细胞周期蛋白基因CCNA2、CCNB1和p34 表达，但上调了 CCND2 基因的表达；提高炎症反应和凋亡相关基因TNFAIP6、PTSG2和Caspase3表达。这表明抑制Wnt/β-catenin通路，导致细胞周期的阻滞，提高了细胞凋亡。 2. FSH信号参与Wnt/β-catenin通路基因表达调控 分别在含FSH（0.1 IU/mL）培养体系和不含FSH体系中添加5 μM IWR-1-endo处理猪卵巢颗粒细胞。结果显示，在 FSH 信号存在时，Wnt/β-catenin 通路的抑制诱导了类固醇激素合成相关基因 CYP19A1和StAR 表达的明显提高；显著上调了 FSHR和LHCGR 基因的表达，降低 ESR2 基因的表达。在无 FSH 信号时，IWR-1-endo 抑制Wnt/β-catenin通路，明显地降低CYP19A1、StAR和CCND2基因表达，提高FSHR基因的表达。本试验结果显示Wnt/β-catenin通路调控了猪卵巢颗粒细胞雌激素等类固醇激素的分泌和多种促性腺激素受体的表达， FSH 信号通过 Wnt/β-catenin 通路下游的β-catenin/TCF转录因子调控了FSH靶基因的表达。 3.褪黑素对Wnt/β-catenin通路的调控诱导颗粒细胞增殖和基因表达 不同浓度褪黑素（DMSO，0.01，0.1，1，10，100 ng/mL）处理猪卵巢颗粒细胞48 h，显著提高了细胞活力，其中0.1 ng/mL褪黑素处理效果最佳。0.1 ng/mL褪黑素上调了Wnt/β-catenin通路表达水平，提高周期蛋白基因CCNA2和CCNB1表达，下调CCND2表达；升高类固醇激素合成相关基因 CYP19A和 StAR 的表达；削减炎症相关与凋亡相关基因TNFAIP6、PTSG2和Caspase3表达，抑制细胞凋亡。本试验结果表明褪黑素能通过诱导Wnt/β-catenin通路激活，提高细胞周期活动，抑制细胞凋亡，并能促进雌激素等类固醇激素合成。 4. Wortmannin抑制PI3K通路对Wnt/β-catenin通路的影响 不同浓度（DMSO，0.1，1，1.5，3，5 μM）Wortmannin处理猪卵巢颗粒细胞48 h，结果证明不同浓度的Wortmannin处理颗粒细胞，抑制β-catenin蛋白含量，对应地降低了颗粒细胞活力。其中5 μMWortmannin表现出最佳的抑制作用。5 μM Wortmannin处理猪卵巢颗粒细胞48 h，qRT-PCR检测基因表达。结果显示5 μM Wortmannin显著降低了类固醇激素合成激酶基因CYP11A1和CYP19A1的表达，调控了类固醇激素分泌；下调LHCGR和FSHR的表达，上调了ESR2的表达；增加了PTSG2和Caspace3表达量，促进了细胞凋亡。结果说明，Wortmannin 抑制 PI3K 通路，进而抑制 Wnt/β-catenin 通路，并抑制细胞活力，促进细胞凋亡，减少了颗粒细胞性腺激素受体 LHCGR和FSHR表达，表明PI3K通路与Wnt/β-catenin通路通过相互协作，调控了颗粒细胞的发育。 综上叙述，在猪卵巢卵泡发育过程中，Wnt/β-catenin 通路调控颗粒细胞发育过程中重要的生理活动，褪黑素和PI3K通路与Wnt/β-catenin通路紧密协作，调控颗粒细胞发育活动，保证卵巢发育活动的正常进行。本研究的前期探究结果将为后续的Wnt/β-catenin通路机制分析研究提供可靠科学的理论依据。
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