摘要
结直肠癌是位于消化道的一种恶性的肿瘤。近几十年，随着经济建设的发展，人们的生活方式发生了极大的变化，结直肠癌的发病率和死亡率明显上升。“早发现，早治疗”对于所有癌症来说都是一种十分有效的防治原则，因此，筛选和鉴定结直肠癌早期诊断以及治疗的标志物有益于改善结直肠癌患者的生存与预后。前期我们通过生物信息学技术，分析了多组来自GEO数据库的结直肠癌表达谱芯片数据，发现ETV4在结直肠癌中mRNA的表达量相较于癌旁组织增加了大约100倍，是所有潜在标志物中变化最大的。ETV4（ETS translocation variant4）属于ETS（E26 transformation-specific）转录因子家族，又叫做PEA3或E1AF。根据前期分析结果，我们推测ETV4是一个潜在的癌基因。我们将以此为基础，进一步探究ETV4基因在结直肠癌中的功能以及其临床意义。 （1）ETV4在结直肠癌细胞中高表达并且与患者不良预后相关联 首先我们利用生物信息学技术分析了包括367例结直肠癌组织和667例正常组织的一个GEO数据集，结果显示ETV4在癌组织中的表达量明显高于正常组织。另外，通过生物信息学技术我们还分析了TCGA数据库中结肠（其中癌组织275例，正常组织349例）与直肠（癌组织92例，正常组织318例）的数据，结果也显示癌组织中ETV4表达量高于正常组织。然后我们采用qRT-PCR技术检测了购于Origene公司的结直肠癌cDNA芯片，检测结果显示，与正常组织相比，结直肠癌组织ETV4 mRNA水平明显升高，并且与分级和淋巴结转移正相关。我们进一步采用免疫组化技术检测了购于西安艾丽娜公司的结直肠癌组织芯片（癌组织108例，正常组织10例），结果显示，癌组织中 ETV4蛋白的表达量明显高于正常组织，并且与分级以及淋巴结转移相关。 此外，我们进一步利用生物信息学技术对TCGA数据库中的结直肠癌数据进行了预后生存分析，结果显示，ETV4高表达组中病人的总体生存期低于ETV4低表达组，无病生存率中ETV4高表达病人明显低于ETV4低表达病人。 （2）ETV4促进结直肠癌增殖 基于以上结果，我们想进一步确定ETV4是否可以促进结直肠癌细胞在体外与体内。首先采用慢病毒介导的质粒过表达技术，在结直肠癌细胞HCT116、HT29、RKO中构建了对照细胞系以及稳定过表达 ETV4的细胞系，命名为 Empty以及ETV4。同样利用基于慢病毒介导的RNA干扰技术，在HCT116、HT29以及RKO细胞中构建了稳定敲减ETV4的细胞系以及其对照细胞系，命名为NCsh、ETV4sh。利用Western Blot实验检测了稳定细胞系过表达以及敲减效果.采用CCK8试剂检测了ETV4过表达细胞系与其对照细胞系和ETV4敲减细胞系与其对照细胞的增殖情况，结果显示，与对照细胞系相比，ETV4过表达细胞系增殖能力明显增强,而ETV4敲减细胞系增殖能力明显降低。利用平板克隆实验检测细胞克隆形成能力发现，ETV4过表达后明显增强癌细胞克隆形成能力，而敲减ETV4后抑制癌细胞克隆形成能力。 为了进一步确认ETV4的体内促癌增殖能力，我们首先构建了裸鼠异植瘤模型，具体步骤为：取生长状态相似，大小体重相似（年龄为5周左右，体重为20克左右）的4只雌性裸鼠；在4只裸鼠左后腿上侧部各注射体积为200 ul（细胞数量107个）的ETV4稳定过表达细胞株，在4只裸鼠右后腿上侧部位各注射同样体积和细胞浓度的对照细胞株，同样对另外4只类似大小和年龄的裸鼠注射相同体积和浓度的稳定敲减ETV4细胞以及其对照细胞。然后对这8只鼠进行正常培养，每3天测量一次成瘤的直径（长和宽）并计算瘤体积。结果显示，过表达ETV4后可明显促进肿瘤在体内的生长，而敲减ETV4则抑制肿瘤在体内的生长。此外，在处死裸鼠剥取瘤体时称量瘤体重量，瘤体重量也从侧面说明ETV4促进结直肠癌体内增殖能力。 （3）ETV4促进结直肠癌转移 结直肠癌的恶性转化离不开肿瘤细胞的转移，于是，我们利用细胞划痕实验，检测了稳定过表达ETV4的细胞株以及其对照和稳定敲减ETV4的细胞株以及其对照的迁移能力，结果显示，与对照组相比，ETV4过表达后细胞迁移能力明显增强，而ETV4敲减过后细胞迁移能力明显减弱。我们又利用Transwell迁移和基质胶侵袭实验检测几组细胞迁移和侵袭能力，结果显示ETV4过表达后明显促进结直肠癌细胞侵袭与迁移能力。接着我们检测了ETV4在体内的促癌转移能力，首先取生长状态相似，大小体重相似（年龄为5周左右，体重为20克左右）的16只雌性裸鼠，随机分成4组，分别通过裸鼠尾静脉注射400 ul（细胞数量为107个）的ETV4稳定过表达细胞株以及相同体积和浓度的对照细胞；以及同样体积和浓度的稳定敲减ETV4细胞和对照组细胞。然后将这16只鼠用相同的培养条件培养，每隔两天观察，等到有部分裸鼠出现身体消瘦并伴有呼吸困难时停止培养，处死裸鼠并解剖后观察（肺部），并对肺脏进行剥离称重保存。进一步对肺部组织进行切片，HE染色，计算癌结节，结果显示，ETV4在体外与体内都可促进结直肠癌细胞的转移。 综上，本研究表明，ETV4在体外与体内都可以促进结直肠癌细胞的增殖和迁移，而 ETV4在结直肠癌中高表达，并且与其不良预后相关。本研究从多个方面证明了ETV4的促癌增殖与转移能力，为进一步研究其作用机制以及后续新型靶向药物以及诊断靶标的开发提供了分子基础，具有十分重要的意义。
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