摘要
沙门菌(Salmonella)是全球范围内常见的食源性致病菌，可广泛感染哺乳类、鸟类、爬行动物、两栖动物等。人类可由多种途径感染，其中通过畜禽产品是最主要的感染途径。沙门菌分型复杂，目前仅根据血清型方法可初步分为近2600种血清型，但由于分型血清价格较高、影响分型试验的因素多，其应用于揭示病原菌之间关系时存在较大缺陷。随着分子生物学发展，将血清分型与分子分型相结合可极大提高对沙门菌分型的准确性。随着抗菌药物的应用，在抗生素的选择压力下，沙门菌耐药菌株不断增多，超级耐药菌株的发现更给公共卫生提出了新的挑战。本文研究了我国1950～2009年间60株动物源沙门菌分离株的血清型、MLST分型分布情况，并对样品进行了耐药性检测和致病性研究，建立了相应的基础数据库，为沙门菌的检测、追踪溯源和防控提供基本信息。 (1)本研究中60株动物源沙门菌，其中鸡源分离株33株(55％)，猪源分离株25株(41.67％)，马源分离株2株(3.33％);血清型分型共分为7个血清型，其中猪霍乱沙门菌（Salmonella choleraesuis）、肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis）和鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）三种血清型分离率位于前三位，分别占总菌株数的31.67％(19/60)、26.67％(16/60)和21.67％(13/60)，其余鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）、马流产沙门菌（Salmonella Abortusequi）、田纳西沙门菌（Salmonella Tennessensis）和印第安纳沙门菌（Salmonella Indiana）分别为10％(6/60)、3.33％(2/60)、3.33％(2/60)和3.33％(2/60)。血清型具有明显的时代特征，1950-1969年猪作为畜牧业中主要的养殖动物所受重视程度较高，分离的沙门菌血清型以猪霍乱沙门菌为主(12/20)，而鼠伤寒沙门菌(2/20)、鸡白痢沙门菌(4/20)和肠炎沙门菌(2/20)均有分离;1970-1989年分离的沙门菌血清型猪霍乱沙门菌(7/20)与鸡白痢沙门菌(7/20)比例相同，除鼠伤寒沙门菌(4/20)外，还分离到了马流产沙门菌(2/20);1990-2009年我国畜禽养殖出现了集约化养殖的趋势，分离的沙门菌绝大多数是禽源沙门菌，血清型主要是肠炎沙门菌(14/20)，此外还分离到田纳西沙门菌(2/20)和印第安纳沙门菌(2/20)。MLST分型共有9个ST型，ST68、ST11、ST92所占比例较高，分别为30％(18/60)，26.67％(16/60)和15％(9/60)，其余各菌株ST型所占比例为ST19:10％(6/60)、ST132:6.67％(4/60)、ST17、ST251和ST319均为3.33％(2/60)、ST139:1.67％(1/60)。MLST分型结果与血清型分型结果对应性良好，ST11为肠炎沙门菌、 ST17为印弟安那沙门菌、ST92和ST132为鸡白痢沙门菌、ST319为田纳西沙门菌、ST68和ST139为猪霍乱沙门菌、ST19为鼠伤寒沙门菌、ST251为马流产沙门菌。此外试验结果显示MLST分型能力要略高于血清学分型方法，可以一定程度的区分分离株，在同一血清型内不同分离株间进一步分析其系统进化和亲缘关系。 (2)本研究中沙门菌样本对氨苄西林(AM)、多西环素(DOX)、四环素(TE)和磺胺异恶唑(SF)药敏试验结果呈现双峰式分布，耐药菌株与敏感菌株MIC分布相对集中;超过30％的菌株对多黏菌素(CL)低敏，所有菌株对美罗培南(MEM)高敏。由于阿莫西林/克拉维酸(A/C)、庆大霉素(GM)、大观霉素(SPF)、氧氟沙星(OFL)、恩诺沙星(ENR)和复方新诺明(SXT)这6种抗生素的抑菌效果较好，其耐药菌株比例均小于5％，头孢噻呋(CEF)、氟苯尼考(FFC)和头孢他啶(CAZ)的抑菌效果稍弱，分别有11.67％、8.33％和6.67％的菌株对其耐药。按照菌株分离时间统计，1950-1959年间分离的沙门菌对药物敏感性很高，仅有1株细菌对DOX处于中介值，其余菌株对15种抗生素均敏感;1960-1969年间菌株对CAZ、GM、SPF和CL敏感的菌株有所减少，有4株菌株对SPF处于中介值，有2株分离株对CL耐药;1970-1989年间分离的沙门菌对DOX、GM、SPF和CL均有耐药菌株的产生，总体上处于中介值以上的菌株数量上与60年代差别不大;1990-1999年间，沙门菌耐药性突然增强，超过50％的菌株对AM、TE、SF和CL产生了耐药性，60％的菌株对ENR的药敏性处于中介值;2000-2009年间分离的沙门菌株中，超过了50％的菌株对AM、SF、TE、DOX、CL和CEF产生耐药性，并且对除美罗培南外的14种抗生素均有耐药菌株的产生。 本研究中有23株沙门菌对抗生素耐药，其中5株沙门菌仅对1种抗生素产生耐药性;18株沙门菌对2种及以上抗生素产生耐药性;4重、5重耐药菌株所占比例较大，分别有9株(50％)、6株(33.33％)。对抗生素耐药谱分析共有12个耐药谱，其中AM-TE-DOX-SF为主导耐药谱，所占比例为22.22％，50％的沙门菌仅有1种耐药谱。根据菌株分离时间分析其耐药谱，1990年代主导耐药谱为AM-TE-SF-CL和AM-TE-DOX-SF，2000年代主导耐药谱为AM-TE-DOX-SF-CL，其次为AM-TE-DOX-SF。综合分析各耐药谱发现，共有12株沙门菌含有AM-TE-SF耐药组合，占所有多重耐药菌株的66.67％，该组合应已成为一个固定耐药谱。 本研究针对磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类和喹诺酮类的耐药基因分别应用14对引物进行检测，其中sul2、blaTEM和tet(A)等3种耐药基因检出量较高，分别占被检样品的76.19％、71.43％和61.90％，aac(6)-1b和floR占23.81％，aacC4和tet(G)占19.05％,blaOXA占14.29％,blaCMY、blaPSE、blaSHV、catA1、qnrA和qnrB等6种基因未被检出，耐11种以上的两种耐药菌均检出携带有blaOXA、aacC4、aac(6)-1b、floR和tet(A)，此基因组合可能是其成为超级耐药克隆的主要原因。 (3)本研究中选用ICR小鼠作为实验动物，建立统一的动物模型，可快速对不同动物源的沙门菌致病性进行比对。根据研究结果，60株沙门菌对ICR小鼠ID50的致病菌量主要集中于107CFU，占总菌株的41.67％，1960-1989年分离菌株ID50致病菌量集中在108CFU，占该时间段分离菌株的50％，2000-2009年间分离的沙门菌毒力最强，ID50中位数为1.41×107，1960-1969年分离的沙门菌毒力最弱，中位数为12.28×107，比较各年代沙门菌菌株间标准差发现其波动幅度较大，表明不同年代菌株间致病性差异明显。研究不同血清型沙门菌的致病性发现，印第安纳沙门菌致病最强，ID50为106 CFU，其次为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，ID50为107 CFU，猪霍乱沙门菌、鸡白瘌沙门菌、马流产沙门菌和田纳西沙门菌ID50为108 CFU。相同血清型不同菌株比较，鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、田纳西沙门菌和印第安纳沙门菌各菌株ID50相近，猪霍乱沙门菌、鸡白痢沙门菌和马流产沙门菌差异显著;分析沙门菌ST型与致病性关系，ST139致病性最强，ID50为4.4×106CFU，其次为ST17菌株，ID50菌量为9×106 CFU，ST19、ST11和ST92菌株ID50菌量为107 CFU，ST68、ST132、ST251和ST319的ID50菌量为108 CFU。比较各ST型菌株致病性标准差，ST19、ST11、ST132、ST17和ST3195种ST型菌株标准差均小于5，菌株间致病性差异不显著，ST68、ST92和ST251标准差约等于10，差异显著。以上结果表明致病性与血清型/ST型存在相互对应关系，血清型/ST型不同，致病性也有差异，同型菌株间的差异程度与致病性强弱无关，仅与型特异性相关。本研究中共22株沙门菌具有耐药性，其中1株超级耐药菌（耐药种类12种）致病性最强，ID50为7×105 CFU，其他多重耐药菌株（耐药种类＞2）ID50的Med均在107 CFU，1株双重耐药的菌株ID50为1.2×109CFU，其余仅对一种抗生素有耐药的菌株的ID50为108 CFU。基于本研究，我们推断沙门菌耐药性增强能够促进其致病性。 结论: (1)研究中60株动物源致病性沙门菌共有7个血清型9个ST型，血清学分型结果与MLST分型结果进行对应比较，大多ST型均可与血清型有比较固定的对应关系，沙门菌分型结果与分离年代有明显相关性。 (2)样本中对AM、TE、DOX、SF和CL等五种抗生素产生耐药性的菌株分离率较高，形成一个AM-TE-SF耐药谱（分离率为66.67％）。耐药基因检测方面，blaTEM、sul2和tet(A)等3种耐药基因检出量较高。 (3)沙门菌致病性为型特异性特征，仅与沙门菌的血清型/ST型相关。耐药性与致病性关系有待进一步研究证实。
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