摘要
铜绿假单胞菌芳香硫酸酯酶（PAAS）为专利保护单通道双酶同测ELLSA新方法的候选配对标记酶及潜在化学发光新标记酶，对其进行分子工程改造筛选高活性突变体过程中，首次发现在最适反应pH及温度下，以对硝基苯酚硫酸钾(PNS)为底物、不存在任何抑制剂的反应体系中，PAAS/突变体有不同程度的反应失活现象，即自催化反应失活。通过动力学测定、抗PAAS多克隆抗体和特定多肽影响及结构分析等表征，推测可能机制，由此建立并优化自催化反应失活动力学模型，且拟合抗PAAS多克隆抗体和多肽影响的动力学过程，从而探讨PAAS自催化反应失活机制，并探索与其失活相关结构因素，以期在分子改造过程中合理阻断PAAS反应失活。 1. PAAS/突变体反应失活 1)同一反应条件下，连续监测PAAS/突变体在相同底物浓度及不同底物浓度下反应动力学曲线，PAAS/突变体作用于其合成底物PNS时，动力学曲线出现不同程度的弯曲现象，即自催化反应失活；反应失活程度与底物浓度有关。突变体M72K反应失活现象最明显；超高分辨质谱检测催化反应前后酶分子改变，发现M72K有氨基酸硫酸化共价修饰； 2)引入抗PAAS多克隆抗体及合成的多肽(检测出发生硫酸化修饰的氨基酸片段)，检测它们对M72K催化反应失活的影响，发现其曲线弯曲程度有明显的缓解； 2. PAAS定点突变体M72K反应失活模型的建立和分析 根据文献报道硫酸酯酶催化水解PNS机制提出经典模型，但据此无法模拟产物积累和硫酸化酶中间体积累过程，且由实验结果推测，创见性提出M72K双活性中心反应失活动力学模型，通过迭代数值积分拟合设定参数组合，计算M72K反应失活曲线获得最优参数解。此双活性中心反应失活动力学模型能很好模拟M72K催化反应产物积累和硫酸化酶中间体积累过程，并与King-Altman方法所得酶中间体瞬时值结果一致。由此证明模型结果的可靠性。 3. PAAS定点突变体M72K反应失活模型的应用 应用双活性中心反应失活动力学模型，拟合多肽、抗PAAS多克隆抗缓解M72K反应失活曲线，进一步阐释PAAS/M72K反应失活机制。 综上所述，PAAS/突变体催化失活与硫酸化修饰没中间体有关，这一失活现象可被抗PAAS多抗和特定多肽有效缓解；由此提出双活性中心反应失活假设，并建立了相应动力学模型。模型结果与经典酶学King-Altman分析结果一致，初步证明此动力学模型的可靠性性，为PAAS分子改造发现高活性、高稳定性且无反应失活的突变体提供理论依据。
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