摘要
DNA甲基化抑制剂5-Aza-2'-Deoxycytidine(5-Aza-dC)是第一个被美国FDA批准，用于治疗人类急性粒细胞白血病的表观修饰药物之一，它能与DNA甲基转移酶DNMT竞争性结合抑制其活性，阻断抑癌基因DNA甲基化反应，是广谱抗肿瘤药物。最新研究表明，在结肠癌和卵巢癌中，5-Aza-dC可激活内源性反转录病毒(ERV)来诱导Ⅰ型干扰素反应，进而发挥抗肿瘤作用。禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)诱发的慢性传染性肿瘤病，对家禽业危害巨大。禽白血病的防治，一直是困扰家禽业的世界性难题。本研究发现，DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC同样具有激活内源性反转录病毒进而抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。由于ERV大多因为突变、缺失而失去编码蛋白的能力，是体内重要的长非编码RNA来源。那么，5-Aza-dC是否通过诱导ERV产生的长非编码RNA来发挥抗肿瘤抗病毒的功能呢？基于以上科学问题，主要研究内容如下: (1) DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC具有抑制禽白血病病毒ALVJ的功能。本研究先用禽白血病病毒ALVJ感染鸡胚成纤维细胞CEF24 h，再通过5μM5-Aza-dC处理感染ALVJ的鸡胚成纤维细胞96 h，以此探究5-Aza-dC对ALVJ的抑制作用。研究结果表明，5μM5-Aza-dC处理CEF细胞对其细胞增殖和活性并没有影响，通过Westenbolt分析可知，5-Aza-dC处理感染ALVJ的CEF细胞能显著抑制ALVJ病毒囊膜蛋白的分泌，即抑制ALVJ病毒的增殖。共聚焦免疫荧光结果也表明，5-Aza-dC处理感染ALVJ的CEF细胞能显著抑制ALVJ病毒的增殖水平。为了进一步揭示5-Aza-dC抗病毒机制，利用高通量测序技术筛选和鉴定源于鸡内源性反转录病毒的长非编码RNA(ERV-lncRNA)。转录组测序结果发现，5-Aza-dC不仅具有激活天然免疫相关基因的功能，而且还诱导长非编码RNA的大量表达。不仅如此，序列比对分析发现，405条差异表达的长非编码RNA中共有59条来源于鸡内源性反转录病毒。这些差异表达的ERV-lncRNA中，5-Aza-dC处理后表达量显著上调的共有51条，显著下调的仅有8条。由此表明，5-Aza-dC抑制禽白血病病毒ALVJ增殖，司能与其激活的天然免疫相关基因有关，也可能与异常激活的ERV-lncRNA有关。 (2)源于鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1的鉴定。为了验证源于鸡内源性反转录病毒衍生的lncRNA是否参与5-Aza-dC的抗病毒功能，本研究选择5-Aza-dC处理后表达水平上调最大但序列长度不超过3000nt的ERV-lncRNA作进一步功能验证。因此，本研究选择长非编码RNA ALDBGALT0000000876进行序列鉴定和功能验证。经序列比对发现，该lncRNA源于鸡内源性反转录病毒ALVE1，与外源性禽白血病病毒ALVJ同源性很高。通过3'和5'RACE技术，鉴定ALDBGALT0000000876两端序列，研究结果发现，获得的全长序列大小为2136 nt，因转录方向与ALVE1相反，因此命名为lnc-ALVE1-AS1。接着，通过地高辛标记的特异性探针杂交lnc-ALVE1-AS1，Norther Blot结果显示lnc-ALVE1-AS1真实存在。进一步通过生物信息学分析其蛋白编码潜能和二级结构，结果表明lnc-ALVE1-AS1不编码蛋白，同时其二级结构复杂或为功能机制研究提供参考。为进一步确认lnc-ALVE1-AS1是否编码蛋白，设计了三种不同编码可能的HA融合的编码序列，经Western blot分析表明，lnc-ALVE1-AS1不编码蛋白，即lnc-ALVE1-AS1是长非编码RNA。另外，通过RNA FISH技术确定lnc-ALVE1-AS1的亚细胞定位，结果表明lnc-ALVE1-AS1定位至胞质和细胞核，且主要分布在胞质。 (3)长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1具有激活抗病毒天然免疫反应的功能。为了弄清lnc-ALVE1-AS1的生物学功能，尤其在天然免疫抗病毒方面的功能，本研究分析lnc-ALVE1-AS1功能获得和缺失后对天然免疫相关基因表达水平的影响。通过构建lnc-ALVE1-AS1过表达载体，将lnc-ALVE1-AS1全长定向克隆至pcDNA3.1表达载体以实现lnc-ALVE1-AS1瞬时过表达。同时构建GFP和lnc-ALVE1-AS1反义序列的表达载体作为Mock对照。结果表明，过表达lnc-ALVE1-AS1与MOCK对照组相比，显著激活Ⅰ型干扰素相关的转录因子IRF7和STAT1表达，同时IFN-β的表达水平也上调了近4倍，提示过表达lnc-ALVE1-AS1能够诱导Ⅰ型干扰素表达。另外，通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测鸡相关的干扰素刺激基因(ISGs)的表达水平，包括IFI27-L2、IFIT5、MX1、OASL、RASD2和ISG12-2在内的6个基因均显著上调，甚至干扰素刺激基因RASD2的表达水平高于对照组40多倍。接着，通过RNAi干扰lnc-ALVE1-AS1表达，结果表明，转录因子IRF7和STAT1表达水平相应降低，IFN-β表达水平也显著降低;同时干扰素刺激基因表达水平也显著降低。总之，lnc-ALVE1-AS1功能获得和缺失后，均影响鸡胚成纤维细胞Ⅰ型干扰素相关转录因子的表达水平，进而影响干扰素刺激基因，表明lnc-ALVE1-AS1在激活Ⅰ型干扰素反应过程中起着关键角色。 接着，先用ALVJ感染鸡胚成纤维细胞24h，再通过转染lnc-ALVE1-AS1过表达载体，进一步验证lnc-ALVE1-AS1是否抑制禽白血病病毒ALVJ。ELISA结果表明，与对照组相比，感染ALVJ的CEF细胞中过表达lnc-ALVE1-AS1后，ALVJ分泌p27蛋白水平显著被抑制;同时，检测其细胞培养液中ALVJ病毒滴度，结果表明，与对照组相比，过表达lnc-ALVE1-AS1后细胞培养液中ALVJ病毒滴度显著下降;接着，通过间接免疫荧光试验表明，过表达lnc-ALVE1-AS1后显著抑制禽白血病病毒ALVJ的增殖。总之，源于鸡内源性反转录病毒的lnc-ALVE1-AS1具有激活Ⅰ型干扰素反应并抑制禽白血病病毒ALVJ的能力，该结果也间接揭示了源于鸡内源性反转录病毒的lnc-ALVE1-AS1可能在5-Aza-dC抗病毒过程中发挥重要的作用。 (4)长非编码RNA诱导Ⅰ型干扰素反应而发挥天然免疫抗病毒功能的分子机制。为了阐明lnc-ALVE1-AS1是如何诱导Ⅰ型干扰素反应而发挥天然免疫抗病毒的功能，进一步研究lnc-ALVE1-AS1与核酸识别因子之间的关系。结果表明，过表达lnc-ALVE1-AS1显著诱导长dsRNA识别因子IFIH1和短dsRNA识别因子TLR3的表达水平，采用RNAi干扰lnc-ALVE1-AS1表达水平时，IFIH1、TLR3和dsDNA识别因子MB21D1表达水平也相应下降。由此，推断过表达lnc-ALVE1-AS1诱导天然免疫反应，很大程度与双链RNA识别因子TLR3和IFIH1有关。进一步，通过生物素标记lnc-ALVE1-AS1，利用RNApulldown技术检测lnc-ALVE1-AS1结合蛋白。质谱分析结果表明，TLR3可在体外结合或识别lnc-ALVE1-AS1。另外，进一步利用RNAFISH和免疫荧光结合的技术，结果表明TLR3和lnc-ALVE1-AS1出现共定位现象。由此表明，TLR3是lnc-ALVE1-AS1诱导天然免疫反应的核酸识别因子。 总之，基于以上结果表明，内源性反转录病毒ALVE1通过衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能有效抑制外源性反转录病毒-禽白血病病毒ALVJ的增殖，说明内源性反转录病毒ALVE1并非“垃圾序列”或“转录噪音”，而是具有重要的生物学功能，尤其在天然免疫反应中扮演重要的生物学角色。该研究结果将有助于了解动物基因组中大量存在的内源性反转录病毒序列的抗病毒天然免疫功能，为更有效地防治禽白血病提供新思路。
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