摘要
里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种嗜温丝状子囊菌，因具有大量生产纤维素酶、半纤维素酶和各种异源蛋白的能力已被广泛应用于工业的各个领域超过70年之久。为了将里氏木霉开发为高产纤维素酶、半纤维素酶和高纯度生产异源蛋白的宿主，本论文开展了以下三方面的研究。 1)通过人工转录因子的构建提高纤维素酶生产 本论文通过人工转录因子—最小转录激活因子和增强转录激活子的构建，提高了里氏木霉纤维素酶的生产。首先，本论文构建了最小转录激活因子DBDace2-VP16和DBDcre1-VP16。这两个因子保留了ACE2和CRE1的DNA结合结构域，用来自单纯疱疹病毒蛋白的激活结构域VP16替换了原始转录因子的转录激活域，并删除了原始因子中其他冗余的真菌转录结构域。DBDace2-VP16和DBDcr1-VP16转化株分别在诱导条件（微晶纤维素或乳糖）和抑制条件（葡萄糖）下提高了纤维素酶的生产。其中，TMTA66在诱导（微晶纤维素）条件，TMTA139在抑制（葡萄糖）条件具有优于其他转化株和亲本菌株RUT C30的纤维素酶活力。TMTA66菌株在微晶纤维素为唯一碳源培养120 h时，其FPase活力比亲本菌株的活力高约1.3倍。TMTA139菌株在葡萄糖为唯一碳源培养72 h时，其FPase活力(U/mg biomass)比亲本菌株高约26.5倍。此外，TMTA66和TMTA139发酵生产的粗酶在补加商业β-葡糖苷酶的情况下能有效水解预处理的玉米秸秆。其次，本论文还构建了增强转录激活子XYR1VP，ACE2VP和ACE1VP，其构建方法是将单纯疱疹病毒蛋白的激活结构域VP16分别连接到XYR1，ACE2或ACE1的C末端。增强的转录激活因子转化菌株TXYR1VP，TACE2VP和TACE1VP提高了纤维素酶和/或木聚糖酶的生产。虽然TXYR1VP菌株废除了纤维素酶的表达，但其木聚糖酶的生产显著提高。与亲本菌株RUT C30相比，TXYR1VP中XylanaseⅠ和XylanaseⅡ活力(U/mg生物量)提高了51％和80％。TACE2VP在微晶纤维素的培养条件下比RUT C30的FPase活力增加了52％。TACE1VP在微晶纤维素的培养条件下比RUT C30的FPase活力提高了80％，且木聚糖酶活力提高了50％。并且TACE1VP生产的粗酶水解预处理的玉米秸秆有比亲本菌株RUT C30产生的更多的葡萄糖。我们的研究为里氏木霉的菌株改良提供了可行的方法。因此，我们构建最小转录激活因子和增强转录激活子的通用且简单的方法为实现提高其他工业产品的生产提供了一种可选的基因工程策略。 2)高纯度生产异源蛋白的通用里氏木霉表达系统的开发 里氏木霉在异源蛋白表达过程中也表达大量的内源蛋白，导致异源蛋白表达纯度下降。本论文通过对重要转录因子的定点突变，启动子的选择，及诱导条件的优化，开发了生产异源蛋白的通用里氏木霉表达系统TXMG。该系统满足了高纯度和高产量生产异源蛋白的需求。TXMG是基于xyn1与xyn2启动子和转录因子XYR1突变(A824V)的里氏木霉转化株。该系统在1％葡萄糖和木糖流加的双组份碳源策略下表达了高纯度的木聚糖酶。本论文也在异源蛋白表达系统TXMG中检测到了红色荧光蛋白基因rfp和来自特异腐质霉的碱性内切葡聚糖酶EGV基因egv3用作报告基因的高纯度表达。该系统有望将里氏木霉应用于工业中生产大量异源蛋白。 3) ACE3参与的里氏木霉纤维素酶基因的转录调控新机制 ACE3与XYR1是里氏木霉纤维素酶基因调控的两个重要转录因子。XYR1的结构及功能已被报道，而ACE3则相对知之尚少。本论文首先鉴定了QM6a来源的转录调控因子ACE3的完整结构。完整的ACE3有734个氨基酸组成，包括Zn(Ⅱ)2Cys6型DNA结合结构域和真菌特异性转录因子结构域。ACE3与XYR1 C末端蛋白结构域是两者调控纤维素酶表达的关键区域，两者C末端与Flag的融合与截短均阻碍甚至废除了纤维素酶的表达。XYR1 C末端的结构同源二聚化也是里氏木霉纤维素酶表达的基础。通过胞内双分子荧光互补实验、细菌双杂交实验验证了ACE3与XYR1两者能在里氏木霉胞内和胞外相互作用。此外，通过EMSA实验证明，ACE3能直接与纤维素酶相关基因cbh1、egl1、bgl2、cip2、cel3c和半纤维素酶相关基因bxl1、 agl1和man1的启动子结合，揭示了ACE3与XYR1相互作用共同调控纤维素酶基因及半纤维素酶基因转录的新机制。另外，我们也初步揭示了ACE3通过直接调控黄色素合成调控基因的ypr1的转录参与里氏木霉黄色素的合成，且其能直接调控crt1的转录及下调bga1的转录参与乳糖的转运与利用。这些结果强有力证明了ACE3在纤维素酶转录调控及自身生长的重要作用。我们的研究进一步拓宽了里氏木霉多种代谢物转录调控的网络，为开发更优良的高产纤维素酶菌株打下了坚实的基础。
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