摘要
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)因其独特的生物特性，在乳酸工业发酵生产中有着极大的应用潜力，但其基因编辑的效率一直不高，极大地增加了凝结芽孢杆菌基因改造操作的难度。CRISPR-Cas9系统作为一种新兴的基因编辑技术具有高效、精确特点，一直受到科学家们的青睐。本课题主要对基于CRISPR-Cas9系统的凝结芽孢杆菌基因编辑方法进行了研究。 本文首先构建了适用于凝结芽孢杆菌ATCC7050的CRISPR-Cas9系统，Western-Blot实验结果表明，经过密码子偏好改造的Cas9n蛋白—BcCas9n蛋白可以在凝结芽孢杆菌ATCC7050中成功表达，随后利用CRISPR-Cas9系统对凝结芽孢杆菌ATCC7050中的ldhL1基因进行突变、敲除和将ldhD基因替换为ldhL1基因，分别获得了ldhL1基因突变菌株、敲除菌株和过表达型菌株。对7株ldhL1突变株的乳酸生物合成进行测定发现，ldhL1基因突变使48h的乳酸产量平均仅为野生型菌株的33％，ldhL1基因的敲除使乳酸的生产接近为0，而将ldhD基因替换为ldhL1基因的过表达菌株，其48h乳酸的产量显著提高了14.7％，L-乳酸光学纯度也由99.43±0.08％提高到99.68±0.06％。这些研究结果也进一步说明，ldhL1基因是影响凝结芽孢杆菌ATCC7050乳酸合成最为主要的乳酸脱氢酶基因。本文研究结果为凝集芽孢杆菌的高效遗传操作奠定了重要基础。
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