摘要
细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，参与生物的生长发育，具有十分重要的生物学功能。低水平的自噬活动对细胞具有保护作用，能降低细胞的死亡率;而高水平的自噬活动则关系到细胞的生存。细胞自噬的发生及调节机制十分复杂，涉及到一系列自噬相关基因的参与。细胞自噬相关基因Atg8首先在酵母细胞中被发现，是一种自噬标记基因。哺乳动物细胞微管蛋白LC3是Atg8的同源物。在细胞发生自噬的起始阶段，Atg8蛋白首先聚集在自噬小体膜上，参与其形成，在这个过程中，部分Atg8蛋白的C末端被半胱氨酸蛋白酶Atg4切割后被磷脂酰乙醇胺修饰形成Atg8-PE，而Atg8-PE/Atg8的比例表示细胞自噬的水平。 本研究根据同源物种中Atg8基因的高度保守性，先设计简并引物扩增得到棉铃虫Atg8基因部分特异性片段的序列，最后采用RACE技术获得Atg8基因的全长序列。由于Atg8是一种自噬标记基因，通常用不同标签的Atg8融合蛋白来研究自噬。目前的研究主要集中于鳞翅目昆虫Atg8基因的表达特征，关于标签蛋白对Atg8分子特征的影响的报道较少。我们通过构建不同标签的Atg8融合蛋白表达载体，研究Atg8蛋白在鳞翅目昆虫细胞中的定位，结果发现大部分Atg8蛋白以点状化分布于细胞质中。但是当我们将构建成功的重组质粒pEGFP-N1-IE2-mCherry-Atg8、pEGFP-C1-IE2-EGFP-Atg8转染鳞翅目昆虫细胞系时，发现Atg8蛋白定位于细胞质和细胞核内，Western Blot技术检测表明mCherry-Atg8融合蛋白未发生切割，而EGFP-Atg8融合蛋白发生了剪切，并且Atg8融合蛋白发生剪切与否均能进入细胞核。将构建完成的pEGFP-C1-IE2-EGFP-Atg8和pEGFP-N1-IE2-EGFP-Atg8转染Th细胞，48h后提取其细胞总蛋白，通过Western Blot技术发现，定位不同且表达量不同的EGFP-Atg8融合蛋白的条带大小一致，并且EGFP-Atg8融合蛋白在细胞内的定位与其表达量有关。当融合蛋白低表达时，大部分Atg8融合蛋白以点状化分布于细胞质中;当融合蛋白高表达时，部分融合蛋白由细胞质进入细胞核，进入细胞核的融合蛋白不再以点状化分布。通过构建一系列突变载体，转染鳞翅目昆虫细胞系，发现Atg8蛋白的第77、79和116位氨基酸是影响Atg8蛋白功能和定位的关键氨基酸。利用Western Blot技术检测标签对Atg8蛋白加工的影响时，发现HA标签可能影响Atg8蛋白的剪切。 以棉铃虫为实验材料，采用RNAi技术验证自噬相关基因Atg8在昆虫生长发育过程中的作用。选择五龄左右的棉铃虫，利用Western Blot技术检测Atg8蛋白在棉铃虫各组织中的表达丰度，发现脂肪体和中肠中表达量最高。本研究采用显微操作仪，将4μg Atg8-dsRNA注射进每只五龄第一天的棉铃虫体内。48h后取其中肠组织，利用实时荧光定量技术和Western Blot技术，检测发现棉铃虫自噬相关基因Atg8的转录水平大约下降50％，在此基础上，统计实验组和对照组棉铃虫幼虫的体重、棉铃虫一生的产卵量和卵的孵化率，运用统计学分析发现:与对照组相比，实验组棉铃虫的产卵量以及卵的孵化率下降20％左右。
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