摘要
鸡的Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ，FAdV-Ⅰ)分为12个血清型，共包含5个亚群，分别是:A亚群(FAdV-1)、B亚群(FAdV-5)、C亚群(FAdV-4和FAdV-10)、D亚群(FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9和FAdV-11)和E亚群(FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a和FAdV-8b)。2015年之前，这些血清型的禽腺病毒在不同国家均有报道，呈现零星发病或亚临床感染状态。而从2015年夏季开始，我国华东地区的鸡群发生了一种急性包涵体肝炎-心包积液综合征，该病由血清4型禽腺病毒流行株引发，迅速蔓延至全国各省的家禽、水禽之中，对我国养禽业造成了重大的损失。 衣壳是禽腺病毒的表面抗原，主要由3种结构蛋白组成，分别是五邻体、六邻体和纤突蛋白(Fiber-1、Fiber-2)。纤突蛋白Fiber-2位于禽腺病毒的表面，头大身细，状如火柴。纤突蛋白能够识别宿主细胞的特异性受体，从而使病毒通过吸附作用结合到宿主细胞的表面。 本研究根据GenBank发布的FAdV-C群血清4型ON1毒株的fiber-2基因核苷酸序列设计了一对引物。以最近分离的流行株(HN株)的DNA作为PCR模板，扩增出大小为1440bp的特异性片段。将该片段克隆到pCold-TF原核表达载体中，转化到宿主菌DH5α感受态细胞内，经测序验证后，命名为pCold-Fiber-2。随后，将pCold-Fiber-2转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆，16℃低温摇菌，再加入IPTG以诱导目的蛋白的表达。超声波裂解菌体后进行SDS-PAGE分析，鉴定表达获得的特异性条带。为了便于检测，本研究设计了一对引物将fiber-2基因片段构建到真核表达载体pcDNA3中，命名为pcDNA3-Fiber-2。将pcDNA3-Fiber-2转染入293T细胞中，真核表达Fiber-2。36h后弃去培养基，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液收集细胞，超声波裂解。经蛋白免疫印迹(WB)验证，Fiber-2蛋白成功表达。 用原核表达的Fiber-2免疫六周龄雌性Balb/c小鼠，经过四次免疫后，检测小鼠多抗血清的IFA或WB效价。挑选阳性效价最高的一只小鼠，进行加强免疫一次。72h后将该受免小鼠的脾脏小心分离，收集脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用HAT选择培养基、ELISA和IFA筛选出阳杂交瘤细胞株，有限稀释法二次亚克隆获得稳定的杂交瘤细胞株，命名为1B5、1C6、2A9和3H11，其中1C6具有WB效价。 将原核表达的Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗进行攻毒保护试验，分为1次免疫组和2次免疫组。结果发现:攻毒未接种疫苗组全部死亡，而攻毒接种疫苗组全部存活。可见，Fiber-2亚单位疫苗拥有良好的免疫保护效果。针对Fiber-2的研究将为进一步探索血清4型禽腺病毒的免疫学功能、发病机制和临床快速诊断等奠定基础。
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