摘要
心力衰竭是多种心血管疾病如冠心病、高血压、瓣膜病、心肌病、先心病等的共同终点。然而心力衰竭的治疗一直是心血管疾病治疗中的难点，其根源在于对发病机制认识的不足。心肌重构是机体应对心室压力负荷增高的一种代偿反应，其主要表现包括心肌肥厚、心肌细胞肥大、心肌纤维化增多等。研究表明，心肌重构在心力衰竭的发生发展中起到重要作用。深入研究心肌重构对提高心力衰竭的治疗水平至关重要。目前，心肌重构的发病机制尚未完全明确，仍有待进一步研究。 NIMA相关激酶6[(never in mitosis gene A)-related expressed kinase6，Nek6]是Neks(NIMA related kinases)家族的重要成员之一。其广泛表达于动植物体内。在哺乳动物中亦可表达于多个器官，其中以骨骼肌和心脏中的表达量最高。研究表明Nek6与细胞周期的调控和肿瘤的发生密切相关，然而其在心血管疾病中的作用尚不明确。研究Nek6对心肌重构的作用，有助于进一步阐明心肌重构的机制，从而为心肌重构乃至心力衰竭的防治提供新的靶点。 目的: 本研究旨在明确Nek6对心肌重构的影响，并阐明其可能的作用机制。 方法: 第一部分:运用扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者和正常人的心脏标本，通过Western Blot检测不同心脏样本中Nek6的表达差异。通过胸主动脉缩窄(Aortic Banding，AB)术，构建压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型。通过Western Blot检测，比较AB组与假手术(Sham)组小鼠心脏中Nek6表达的差异。利用心肌组织切片的免疫组化，观察Nek6在心肌细胞中的表达部位及AB术后表达量的变化。 第二部分:采用Nek6基因敲除（Knockout，KO）小鼠和C57BL/6(Wild type，WT)小鼠为实验对象，运用AB术构建压力负荷诱导的心肌肥厚模型。运用超声心动图评估小鼠的心功能的变化。比较心重/体重比(Heart weight/Body weight，HW/BW)、肺重/体重比(Lung weight/Body weight，LW/BW)和心重/胫骨长度比(Heart weight/Tibial length，HW/TL)评估小鼠心脏及肺脏的重量改变。通过心脏的大体拍照和心脏组织切片的HE染色，评估小鼠心脏体积及心肌细胞横截面积的改变。通过心脏组织切片的PSR染色，评估小鼠心肌间质胶原含量的变化。运用RT-PCR检测心肌肥厚和心肌纤维化标志物mRNA表达量的改变。利用Western Blot检测相关信号通路中蛋白表达量的改变，并探寻可能的分子机制。 第三部分，采用大鼠H9c2心肌细胞和经pCMV-Nek6转染的H9c2心肌细胞(Transgene，TG)为研究对象。通过血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)刺激构建心肌细胞肥大模型。通过免疫荧光比较心肌细胞横截面积的改变。利用Western Blot检测相关信号通路中蛋白表达量的改变，并探寻可能的分子机制。 结果: 第一部分:人体心脏组织的Western Blot检测提示Nek6在DCM患者心脏中表达量增高。小鼠心脏组织的Western Blot检测显示，AB术后Nek6的表达量明显升高，且术后1周时最为明显，之后升高幅度逐渐下降。免疫组化结果显示，Nek6主要表达于心肌细胞的胞质，且AB术后表达量明显增多。 第二部分:超声心动结果显示AB术后，左室舒张末内径和左室收缩末内径显著升高，且KO组较WT组升高更为明显;射血分数和短轴缩短率显则著下降，且KO组较WT组下降更为明显。心脏及肺脏重量检测结果显示，AB术后HW/BW、HW/TL均明显升高，且KO组小鼠升高更为明显;WT组的LW/BW升高并不明显，但KO组则显著升高。心脏的大体拍照显示，AB术后心脏体积明显增大，且KO组增大更明显。组织切片的HE染色显示，AB术后心肌细胞横截面积明显增大，且KO组增大更明显。PSR染色显示，AB术后心肌细胞间质胶原含量增多，且这一趋势在KO组更明显。应用RT-PCR检测肥厚标志物mRNA表达，结果显示AB术后ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达水平增高，且KO组增高更为明显;α-MHC和SERC2α的mRNA表达水平下降，且KO组下降更为显著。应用RT-PCR检测纤维化标志物mRNA表达，结果显示AB术后CTGF、TGF-β2、CollagenⅠa和CollagenⅢ的mRNA表达水平增高，且KO组增高更为明显。利用Western Blot检测相关信号通路中蛋白表达量的改变，结果显示AB术后，AKT信号通路中的AKT、GSK3β、mTOR、44EBP1、eIF4e和p70的磷酸化蛋白表达量显著增高，且KO组升高更明显，而总蛋白表达量差异不明显。 第三部分，免疫荧光结果显示，予以AngⅡ刺激后心肌细胞横截面积显著增大，且TG组增大幅度弱于H9c2组。利用Western Blot检测相关信号通路中蛋白表达量的改变，结果显示予以AngⅡ后，AKT信号通路中的AKT、GSK3β、mTOR、44EBP1和eIF4e的磷酸化蛋白表达量显著增高，且升高幅度随刺激时间增长而增加。在相同刺激时间时，TG组磷酸化蛋白表达量升高幅度弱于H9c2组，而总蛋白表达量变化不明显。 结论: 1.心肌重构可增加心肌组织Nek6的表达; 2.Nek6基因敲除可通过促进AKT信号通路的激活，加剧压力负荷诱导的心肌肥厚和心肌纤维化; 3.Nek6过表达可通过抑制AKT信号通路的激活，抑制血管紧张素Ⅱ刺激诱导的心肌细胞肥大。
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